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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流文献翻译1.精品文档.纳米抗体为基础的酶联免疫法在甲醇中测定在农产品中黄曲霉毒素的耐性摘要：噬菌体展示文库（NB）的重链抗体的重链（VHH）或纳米抗体的可变结构域，通过免疫羊驼与 黄曲霉毒素B1（AFB 1）缀合牛血清白蛋白（AFB 1-BSA）构建，选择特定的二黄曲霉毒素B1纳米抗体。与所获得的纳米抗体相比，抗黄曲霉素的单克隆抗体B5在有机溶剂和高温下更稳定。特别是温度高达95时，暴露在高温中的两个纳米抗体可以与抗原结合 。此外，纳米抗体在有机溶剂显示出较好耐受性。在IC 50值线性范围是从0.117到5.676纳克/毫升中，以纳米抗体Nb

2、26竞争性ELISA可以分析黄曲霉毒素B1测定得出的0.754纳克/毫升（2.4M），由于在甲醇中具有高耐受性，通过纳米抗体的基于ELISA对样品提取分析未经稀释就直接进行分析。从尖刺花生，水稻，玉米和饲料的回收率为80至115。总之，分离纳米抗体是中黄曲霉毒素的测定免疫程序的最佳选择。 黄曲霉毒素首先在20世纪60年代发现的，由于 的“火鸡X”病在从巴西进口的花生粕和其代谢产物UK.1曲霉爆发菌中发现，并且证明是疾病爆发的原因。黄曲霉毒素是一类天然存在的霉菌毒素，主要是由黄曲霉和黑paraciticus生产。他们可发生于多种产品，包括粮食，食品 和饲料。超过20种黄曲霉毒素已鉴定，其中，四黄

3、曲霉毒素（B1，B2，G1和G2）自然发生。黄曲霉毒素B1是最毒的，且所述一个最有力的致癌性的。它已被列为第一类致癌物。这是对人类致癌，由国际机构癌症研究机构（IARC）世界卫生组织（WHO）在1993.3确定。黄曲霉毒素M1 （黄曲霉毒素M1），是黄曲霉毒素B1的代谢产物羟基化。如果被污染的食物或饲料被吞入，它可以是在哺乳动物尿液和牛奶中发现。AFM1污染物可发生在商业奶及奶制品，从而成为潜在的健康危害给人类。 由于高毒性的黄曲霉毒素和致癌性，在食品和农业产品，对于黄曲霉毒素B1或总黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2）检测，许多国家都建立了严格的最大允许限度，变化范围的2至20微克

4、公斤。在食品安全的担忧和官方立法方面，准确而灵敏的测定黄曲霉毒素成为一个重要的需要。各种各样的分析方法可黄曲霉毒素测定，从精确的分析以快速方式（例如，高效液相色谱串联质谱spectrometry6）（例如，imunochromatographic assay7）。黄曲霉毒素特异性抗体不仅需要像immunoassays（免疫测定）的方法，同时也用仪器筛查方法检测用于免疫亲和纯化，它是一个标准的清理过程。 在过去的几十年里，无数的抗黄曲霉毒素已经开发了通过polyclonal（多克隆）和monoclonal(单克隆技术)应用于各种测定法。随着时代的发展分子工程和表面展示技术，抗体生产已经从传统的抗

5、体移动到的重组抗体。黄曲霉毒素特异性重组抗体例如Fab和scFv抗体已经被开发并利用酶联免疫吸附和生物传感器方面。然而，由于这些抗体的低表达产率和稳定性片段，该应用该技术的结果是有问题的。骆驼产生抗体的独特的子类这自然缺乏轻链，称为重链antibody.。重链的抗原结合位点抗体是由重的可变结构域单独形成，这些VHHs链（VHH）重新组合表达可产生单域重链抗体，也称为VHH抗体或纳米抗体。与传统的相比，纳米抗体发展是更容易重组抗体。例如，一个相对小型文库够实现抗原特异性结合剂，只有一对引物是足够的，以放大整个纳米抗体的基因从而表达产率较高，在培养基可达30毫克的L-1。纳米抗体片段具有亲水性残基

6、取代 框架二个区域，从而更可溶比起常规抗体片段。由于它们的单结构域性质，在高温和有机溶剂环境当中，纳米抗体也被证明是更稳定。有了这些好处，纳米抗体在下一代免疫当中是有很好的发展前景。 由于其良好的性能，纳米抗体技术有被广泛地应用于诊断和治疗领域。一越来越多的纳米抗体的已单独分离出小分子应用于更多的免疫测定当中。但是，没有对黄曲霉毒素特异性纳米抗体的报道，除了中国出版评价的两个洗脱效率 在非免疫噬菌体生物淘洗方法显示的VHH 图库对AFB1-BSA的报道，另一份报告是有关抗独特型的黄曲霉毒素的纳米抗体从抗黄曲霉毒素隔离出来的通过单克隆抗体免疫VHH库，这些纳米抗体识别该单克隆的抗原决定簇抗体和可

7、被用作替代物的黄曲霉毒素的半抗原如涂层抗原。免疫文库更直接导致纳米抗体具有较高的亲和力。在本研究中，我们的目标是从免疫噬菌体显示库分离针对黄曲霉毒素纳米抗体来。我们也有兴趣在评估其物理化学性质，并将其与对比单克隆抗体，如耐热性，耐溶剂的效果影响。实验部分材料与试剂。所有试剂均为分析纯级，除非另有规定。 Antiaflatoxin单克隆抗体（mAb）B5产生于我们的实验室。黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2，M1标准，牛血清白蛋白（BSA）， 聚乙二醇8000（PEG8000），弗氏不完全佐剂，3,3，5,5 - 四甲基联苯胺（TMB）和山羊 抗鼠单克隆抗体偶联至辣根过氧化物酶（HRP）购自Si

8、gma（圣路易斯，密苏里州获得 美国）。大肠杆菌ER2738的感受态细胞，大肠杆菌ER2736专线Lucigen公司购 （米德尔顿，WI，USA），顶10F感受态细胞是自Life Technologies（格兰德岛，纽约州）购得。 小鼠抗M13单克隆抗体辣根过氧化物酶（HRP）是购自GE Healthcare（新泽西州Piscataway，USA）。辣根过氧化物酶标记的抗HA标签的鼠标单克隆抗体购自康运生物购 （北京，中国）。辅助噬菌体M13KO7和SfiI位分别为自New England Biolabs（伊普斯维奇，MA，USA）获得。吐温20是由百灵威科技（北京，中国）获得。 xTract

9、or缓冲蛋白提取和His60超流树脂被自Clontech Laboratories公司购（山景，CA，USA）。 QIAprep离心小量制备试剂盒，QIAquick凝胶提取试剂盒和QIA快速PCR纯化套件均来自Qiagen公司。 LeukoLOCK总RNA分离系统自Applied Biosystems（福斯特城得到CA）中。在中光学96孔EIA/ RIA板从购买康宁公司（Corning公司，NY，USA）。 0.01M的磷酸缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中，制备添加了8克氯化钠，2.9克磷酸氢二钠的12H2O，0.2克KH 2 PO 4和0.2g的氯化钾在1000毫升去离子水。 pComb3

10、X噬菌体载体是从卡洛斯F.巴尔巴斯博士（斯克里普斯一份厚礼研究所，拉霍亚，CA）。安全。纯黄曲霉毒素标准的物被处理 要极为谨慎。所有进来的接触项目的黄曲霉毒素，噬菌体和细菌培养物（玻璃器皿，小瓶，试管， ELISA板等）他们被丢弃或高压灭菌前1-2小时，浸渍在的10漂白溶液中。羊驼免疫。一个2岁的雄性羊驼是皮下接种200微克黄曲霉毒素B1-BSA和具有相同 体积的弗氏不完全佐剂。以下注射是在10周的时间内每2个星期进行一次。 免疫前收集血清作为阴性对照。收集1周后的第三，第四，第五和第六的十毫升血液，进行试验滴度和隔离白细胞。噬菌体展示文库的构建。根据本滴度的结果，在第五血液被选择来提取RNA

11、，并构建文库。该库是按照构建金等。简言之，RNA从血液中提取并转录为cDNA。来自IgG2和IgG3的纳米抗体基因片段通过PCR扩增，利用两种不同的SfiI位点引物（下划线），正向引物 VHH-F（CAT GCC ATG ACT GTG CAG GCC GCG GCC CAG KTG CAGCTC GTG GAG TC）针对 框架1区，反向引物VHH-R1（CAT GCC ATG ACT CGC GGC CGG CCT GGC CGT CTT GTG GTT TTG GTG TCT TGG G）和VHH-R2（CAT GCC ATG ACT CGC GGC CGG CCT GGC CAT GG

12、G GGT CTT CGC TGT GGT GCG）分别对应于所述的IgG2和IgG3铰链区。PCR产物和pComb3x 噬菌粒载体分别消化具有SfiI位和 随后连接生成pComb3x/纳米抗体构建。 转入大肠杆菌ER2738后，通过电镀在LB氨苄青霉素琼脂平板上估计库大小。通过的对LB-Amp平板评价库的多样性 ，从而二十克隆被选择。文库淘选。在96孔微量滴定板库进行四轮的洗涤。在1，2，3 和4圆孔中，抗原AFB1-BSA 涂布为1，0.25，0.1和0.05微克。每一淘洗轮使用三个重复。为了消除非特异性结合，三个孔重复都用3BSA的预吸附包衣。 150微升库包被的BSA加入到各孔中在室温

13、（RT）孵育1小时。然后将上清液 转移到涂有抗原的孔中，并温育2小时室温，随后用0.05PBST 10次洗涤。黄曲霉毒素标准被用于竞争性洗脱结合的噬菌体。在10的100L甲醇-PBS用作洗脱缓冲液对50，10，2和1ng的黄曲霉毒素分别洗脱。在RT下温和进行洗脱 振摇30分钟。在每一轮两微升的洗脱溶液用于测试的噬菌体滴度，这 被称为输出滴度，剩余部分放大为下面淘洗。用于淘洗的再扩增噬菌体的滴度也被测试，将其称为输入滴度。水溶性纳米抗体的表达和纯化来自独特的阳性克隆噬菌粒在非抑制的大肠杆菌TOP10F细胞转化并表达。对于表达，通过37 250 转振荡培养条件下，100毫升的SB培养基过夜培养，

14、TOP10F细胞携带纳米抗体的表达质粒。当培养物达到0.6-0.8的OD 600值，加入1 毫摩尔异丙基-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），接着连续振摇过夜。根据制造商的说明书，通过用xTractor缓冲蛋白质得到分离。根据制造商的指示，用的Ni-NTA金属亲和层析将含有6xHis标签纳米抗体被纯化。根据标准，纯度和尺寸纳米抗体用15还原SDS-PAGE进行测定，随后用考马斯亮蓝染色。纳米抗体的浓度为用Bradford方法测定。样品制备。将5克花生，水稻，玉米和饲料用分别称重，并用含有2BSA的70甲醇/ PBS超声波5分钟提取。然后将混合物过滤两次，并在5000g离心10分钟;将上清液直接用

15、于样品分析 。结果与讨论特异性黄曲霉毒素噬菌体克隆的选择。第五次免疫后收集十毫升血，并用于RNA提取。通过PCR扩增，纳米抗体基因进行扩增 ，并连接与pComb3X vector。整个质粒 通过电穿孔大肠杆菌ER2738细胞进行扩增。所构建的噬菌体展示纳米抗体库估计有2.1107个独立的克隆。为了获得高的比抗黄曲霉毒素噬菌体克隆，我们利用所述淘洗策略通过增加选择压力。四次淘洗循环进行以降低包被抗原浓度和游离AFB1在每一轮竞争性洗脱（表1）。为了尽量减少非特异性结合，还进行有力的清洗步骤和预吸附。 从表1中，在每一轮中噬菌体输出滴度将会增加，这表明在淘洗中特定的噬菌体克隆进行富集。从第四输出滴

16、定板中的三十个克隆的随机选择，并通过噬菌体ELISA检测。二十八克隆显示通过自由AFB1包被抗原结合到一个抑制剂。阳性克隆的质粒提取和测序结果表明有两种独特克隆，通过被选定命名为Nb26和Nb28。从图1中 两个克隆都是长铰链VHHs（IgG2）并且框架区是高度保守的。在FR2中两者都包含替换特点，包括在位置37，44，45，和47的F，E，R和F / G，这也解释了纳米抗体的溶解度两个克隆具有相同的CDR1区，并且只有七个氨基酸在CDR2和CDR3区域是唯一的。这可能表明，两种抗体均来自从相同的B细胞和相似的方式绑定黄曲霉毒素。表噬菌体展示纳米抗体的一筛选附表表1对准选定的纳米抗体Nb26和

17、Nb28的氨基酸序列。 在相同的位置已被指出，只有一个唯一的氨基酸残基与上面的（Nb26）不同，点被用于指示残留标识顶端序列。纳米抗体FR2的实线框勾勒的特点是氨基酸取代。 经过4轮筛选，第四输出滴定板的30个克隆被选择，并在3mL SB的扩增培养。过夜培养后，将培养液离心在3000g，20分钟，通过噬菌体酶联免疫吸附测定（ELISA）将上清液再进行其特性。克隆结合的是AFB 1-BSA，而不是BSA，分别视为阳性并选择用于进一步特性。 可溶性纳米抗体的纯化和表达。对于表达，这两个独特的纳米抗体质粒，分别转化到TOP10F，这是一种非抑制大肠杆菌菌株，在没有pIII的蛋白质中，可以允许水溶性纳

18、米抗体的表达。通过纯化上Ni-NTA亲和柱，被6His标签标记的纳米抗体表达才获得的。用15SDS-PAGE凝胶检测纳米抗体的纯度。从图2中，两个纳米抗体的大小为约17 kDa的，这与ProtParam（Expasy）计算值与理论值一致。两种纳米抗体的浓度通过Bradford方法测定。纳米抗体Nb26有5.20.2 mg / L的细菌培养产率，并Nb28为4.20.6毫克/升（纯化的产率表示为装置具有三个独立实验的数标准）图2。 竞争性结合曲线与特定的纳米抗体克隆。 示出的纳米抗体Nb26（）和Nb28（）随着自由AFB1增加量 结合AFB1-BSA的抑制代表曲线。 每个点代表三次重复的平均值

19、。该中所用的包被抗原纯化的纳米抗体的浓度检测分别为是1-0.1和1-0.02微克/毫升Nb26和Nb28。插图显示的是15的凝胶上SDS-PAGE分析纳米抗体Nb26和Nb28的纯化。图3。基于ELISA实验对Nb26（A）和Nb28（B）纳米抗体的的交叉反应对黄曲霉毒素B1（），B2（），G1（），G2（）和M1（）。 每个结果表示为三次重复的平均值标准偏差。在96孔板中涂有1微克/毫升AFB 1的半抗原-BSA 缀合物。 用相等的量纳米抗体，在PBS中进行AFB 1的连续稀释并且测试化合物。100微升体积 混合物加入到孔中。结合纳米抗体是用十分之一000稀释的HRP偶联的抗HA标签单克隆抗

20、体检测表2 AFT化合物（CR）竞争ELISA实验与纳米抗体Nb26和Nb28交叉反应图4中的特定黄曲霉毒素B1纳米抗体Nb26（），Nb28（）和单克隆抗体B5（）耐热性。纳米抗体与常规的单克隆抗体到PBS中稀释浓度，并在20，50，65，75和95不同温度下进行5分钟（A）或在85下，0，5，15，25，35，45和60分钟（B）不同的时间中加热。然后重新equilibated至RT，其结合至涂覆的AFB 1-BSA在微量滴定板进行测定。数值是三次以及重复实验的平均值标准偏差图5为基础的ELISA法，纳米抗体Nb26，Nb28和单克隆抗体在甲醇（A），二甲基亚砜（B），二甲基甲酰胺（C），

21、丙酮（D）和乙腈（五） B5性能影响。含有10，20，40，60和80不同浓度的有机溶剂的PBS缓冲液，分别用来按序列稀释自由黄曲霉毒素。在连续稀释液中混合等体积的纳米抗体Nb26，Nb28或mAb B5，然后100L混合物 加入到孔中。通过加入缀合的抗HA-标记的mAb的纳米抗体HRP100L（在1/10000PBS稀释）和羊抗鼠多克隆结合有HRP的单克隆抗体B5（1/5000PBS稀释）分别检测结合的免疫试剂。值是平均值3次重复的标准偏差。纳米抗体酶联免疫吸附 将纯化的纳米抗体进行测试通过间接竞争ELISA的性能。包被抗原和纳米抗体的浓度分别为由检测盘进行第一优化。从图2中，纳米抗体Nb2

22、6和Nb28表现出类似的性质，具有在IC 50值中黄曲霉毒素B1分别为0.754纳克/毫升（2.4M）和1.012纳克/毫升（3.24M）该测定的特异性用其他四个黄曲霉毒素（AFB2，AFG1，AFG2和黄曲霉毒素M1）进行评价（图3）在（10）交叉反应中观察到AFB2，AFG1和AFG2（表2）。纳米抗体Nb26和NB28的线性范围分别是为0.117-5.676微克/千克 和0.171-6.431微克/千克，比我们以前的单克隆抗体1C11.1的更广温度的稳定性 分离的纳米抗体的热稳定性的特点是通过与抗黄曲霉毒B1单克隆抗体与我们实验室指定的B5进行对比。Nb26和Nb28中的抗体溶液在PBS

23、中制备。该 溶液，在20，50，65，75和95下温育5分钟 在thermocontrolled水浴。后重新平衡至室温， 各样品的直接结合到涂覆AFB 1-BSA 的微孔板中进行测试。从图4A中，人们发现，单克隆抗体B5 通过提高温度而逐渐失去结合能力然而纳米抗体在温度为高从图4A中，人们发现，单克隆抗体B5 通过提高温度而逐渐失去结合能力然而纳米抗体在温度为高达95时仍然可以与抗原结合。为了进一步证明这一点，纳米抗体Nb26，Nb28和mAb B5被加热到85，加热的时间分别为（0，5，15，25，35，45，60分钟）（图4B）。纳米抗体Nb26和Nb28在85下 孵育1小时后，它们的结合

24、活性分别保留约70和40，然而，单克隆抗体的结合活性在培养15分钟丧失 。溶剂效应 具有高的耐有机溶剂的抗体在真实样品的分析是优选的， 尤其是对亲脂性的分析物。中黄曲霉毒素的情况下， 它是高度亲脂性，使用的有机溶剂，如 甲醇和乙腈，在提取过程中是必要的。当基体效应可以忽略不计时微量稀释能够满足分析时的要求。在这项研究中，在甲醇，二甲亚砜（DMSO）中， 二甲基甲酰胺（DMF），丙酮和乙腈的浓度从10至80的存在下，我们调查了下纳米抗体以及单克隆抗体B5的性能。纳米抗体Nb26，Nb28和mAb B5稀释在各溶液中，并最终抗体暴露于在从540 浓度的有机溶剂中;这些结合能力的抗体与抗原随后被测试

25、（图5）。在一般情况下，增加的溶剂中的浓度引起最大的信号减小;然而，纳米抗体呈更好的耐性对于大多数试剂。在80甲醇中，Nb26和Nb28保持其结合能力为100， 而单克隆抗体B5在其中50都失去其活性。类似的结果在用丙酮和乙腈中都可以观察到。与此相反，在单克隆抗体和mAB中，DMSO和DMF这两个有显著和类似的效果 。这个属性有利于亲和柱的发展，在甲醇，丙酮或乙腈中提取样品不需要高度稀释;不过，这个属性是不是可用的在DMSO或DMF中提取的样品。利用的纳米抗体为基础的ELISA分析样品 要应用的纳米抗体为基础的ELISA法进行检测样品的分析，用花生，水稻，玉米和饲料作为代表性样品对基体效应进行

26、评价。甲醇是在黄曲霉毒素分析中最常用的提取溶剂。纳米抗体的基于ELISA法能甲醇浓度高达70下工作，在不同浓度的甲醇构成的标准曲线相对于所述最大OD值和IC 50进行比较.。从图6中，用甲醇浓度的增加，最大OD值增加但是灵敏度降低，其IC50值约3毫微克/毫升。如果基体效应可以忽略不计，将样品提取物可不用稀释直接进行分析。从我们以往的研究，BSA可以充当稳定剂该试验中消除基体效应。在这项研究中，2BSA的70甲醇/PBS并加有了一系列的AFB1浓度来提取样品。从图7中的基体曲线与标准之间没有显著差异曲线的变化。Nb26 和Nb28纳米抗体为基础的测定法的线性范围分别为是2.468- 268.5

27、9微克/千克和3.185-211.24微克/千克，目前其适合于大多数国家的在监管限制（5.0微克/千克）来监测黄曲霉毒素AFB 1浓度 。回收和复性分析是与展开的纳米抗体Nb26基于ELISA实验去验证该测定。在试验前，每个样品被证明含有少于0.1毫微克/毫升的黄曲霉毒素通过高效液相色谱法（HPLC）。总回收率为80115的样品加标黄曲霉毒素B1（表3）。结论 在这项研究中，两个特定黄曲霉毒素性纳米抗体被分离的 和定性。在有机溶剂采用纳米抗体的检测表现出较好的热稳定性和更高耐受性。纳米抗体的高的热稳定性使得它们成为 免疫分析的发展中具有有吸引力，不仅有了较长的保质期，也有利于上 遇到恶劣环境也

28、能实地测试。纳米抗体的这种特性通常是与CDR1和CDR3之间的二硫键相关。虽然，两个纳米抗体分离在本研究中没有形成一个跨CDR二硫键，但仍显示出高的热稳定性。这表明，纳米抗体的热稳定性也可以这样解释，它有展开后适当地重新折叠的能力。除了温度稳定性，通过与黄曲霉素特异性单克隆抗体B5进行比较，纳米抗体还表现出对甲醇，丙酮和乙腈更高耐受性。样品分析可以不经稀释，直接的来进行提取（，在70的甲醇浓度萃取溶液，在35的浓度的甲醇样品试验最终测定的）。这些特性在纳米抗体的应用中大幅提升。例如，纳米抗体可以用于在具有较高的固定化密度生物传感器，也可于用需要较少稀释，以及在高温环境下于亲合层析。图6。 基于ELISA纳米抗体的Nb26（A）和Nb28（B）在甲醇中的性能性影响。含在不同的浓度10，20，40，60，和70甲醇的PBS缓冲液，分别用来使自由AFB 1的连续稀释在连续稀释的纳米抗体Nb26和Nb28等体积的混合，然后将混合物加入100L加入到孔中。通过加入HRP100L的缀合的抗HA-标记的mAb的纳米抗体（在PBS中的1/10000稀释）可以检测结合的免疫试剂。值是平均值标准差（三个孔重复）。图7测定纳米抗体Nb26（A）和Nb28（B）在70甲醇-PBS（），稻（），玉米（），花生（）和饲料（）的基体效应的标准曲线。分析化学第8878 DX。