不对称PCR.ppt

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1、不对称不对称PCR 制作人：张天夫 PCR是体外酶促合成特异是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成成： 即在高温（95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（3755）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链D

2、NA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106107倍。 不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50100 1.在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单

3、链DNA. 不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例. 还有一种方法是先用等浓度的引物还有一种方法是先用等浓度的引物PCRPCR扩扩增，制备双键增，制备双键DNADNA，(dsDNA)(dsDNA)，然后以此，然后以此dsDNAdsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第为模板，再以其中的一条引物进行第二次二次PCRPCR，制备，制备ssDNA.ssDNA. 应用：应用： 不对称不对称PCR制备的制备的ssDNA，主要用于，主要用于核酸序列测定核酸序列测定. 尤为用尤为用cDNA经不对称经不对称PCR进行进行DNA序列分析是研究真核序列分析是研究真核DNA外外显子

4、的好方法。显子的好方法。 不对称PCR（Asymmetric PCR）的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：501：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA（ds-DNA），再以ds-DNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。 全自动PCR仪 :新发展：新发展： 由由Brandeis 大学大学Wangh与他人合作发

5、与他人合作发明的指数线性明的指数线性PCR （LATE-PCR）是一种）是一种新技术，属于不对称新技术，属于不对称PCR的高级形式，在的高级形式，在引物设计时进行革新，并且采用了一种改引物设计时进行革新，并且采用了一种改良的热循环，可以完成可靠的不对称放大。良的热循环，可以完成可靠的不对称放大。如果产生单链，在反应过程中就会累积下如果产生单链，在反应过程中就会累积下来，因此在退火期间，不需要探针就可以来，因此在退火期间，不需要探针就可以获得结果。获得结果。 采用分子信标（beacons），或者是Applied Biosystems公司的TaqMan探针检测退火，因为探针温度必须高于引物的温度，

6、因此，Wangh认为可以引入一种较低的温度检测步骤。方案之一是让热循环与退火步骤一样，但是要在限制性引物用尽之后或者是延伸步骤之后引入。另一方案是将退火温度与检测温度分开。 LATE-PCR创造了一个用于检测的温度空间，在延伸期间，允许探针与一股单链靶子相结合，并且不需要干扰或降解就能使链断裂。在低温分子信标作用下，茎环变短，因此更容易识别等位基因。Wangh 认为这是一个重大突破。LATE-PCR反应的Ct值依赖于目标基因组的原始数目，与对称PCR很相似。但是，不管你怎样开始操作，所有的LATE-PCR反应最终都会产生许多单链产物，不需要任何清除，直接将这些产物用于循环测序法，因此我们将之称

7、为Dilute-N-Go测序。 Wangh还开发了一系列的“Elixirs”试剂，这些试剂以一种独特方式与反应中的成分相互作用，以避免引物错配。他们是高性能DNA聚合酶Hot Start的替代物，但与Hot Start不同，Hot Start只在零度及第一次热反应后存在，而Elixirs在整个反应过程中都存在。Elixirs与其他成分混合在一起，可以避免引物错配的情况发生；但是也会将分离开的基因组链清除掉。他们制止了引物二聚体的出现，改善了有若干成分的多路反应结构。 目前，整个细胞生物学领域中所用的原材料正变得越来越小，尤其是PCR。这有许多优势，但在对称PCR中，则会带来许多问题。如果必须采

8、用更多的循环达到Ct，引物错配及扩增的废物就会增加，这些不需要的产物会与目标扩增物相竞争，会破坏试验结果。在对称PCR中，需要花费大量的时间去优化反应，才能解决这个问题。LATE-PCR设计了高度特意性引物，Elixirs使得反应更快更容易进行。采用PurAmp方法，可以利用单细胞中少量的DNA和RNA分子进行反应。 Shipley 认为LATE-PCR很有趣。采用不相称的引物浓度，却可以获得更精确的结果。但是作为核酸研究团队、生物分子研究设备协会（ABRF）成员，他们也只采用TaqMan或者是SYBR。虽然LATE-PCR很吸引人，尤其是那些对定量PCR感兴趣的人，但对其他人可能不合适。 此外，此外，ShipleyShipley认为，时间和态度是阻碍认为，时间和态度是阻碍PCRPCR革新的原因之一，如果熟悉的一个程序革新的原因之一，如果熟悉的一个程序已经进入一种大规模的使用模式，想要彻已经进入一种大规模的使用模式，想要彻底更换，很难。底更换，很难。