微生物育种复习题.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流微生物育种复习题.精品文档.1、概述工业微生物育种方法一、传统育种方法（一）以基因突变为理论基础的育种方法：（1）诱变育种：是用人工诱变方法诱发微生物基因突变，通过随机筛选，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性能优良的突变体，并找出突变体的最佳培养基和培养条件，使突变体在最适环境条件下大量合成目的产物。诱变、筛选和改变环境因素是诱变育种的3个重要环节。（2）推理育种：是根据微生物代谢产物的生物合成途径和代谢调节机制，选择巧妙的技术路线，通过人工诱发突变的技术获得改变微生物正常代谢调节的突变株，从而人为地使目的产物选择性地大量合成和积累。特点：

2、打破了微生物代谢调节机制这一限制目的产物大量积累的天然屏障；优点：定向、工作量适中、效率高。（二）以基因重组为理论基础的育种方法：杂交育种：通过微生物杂交将不同菌株的遗传物质进行转移、交换、重组，使不同菌株的优良特性集中于一个重组体中。可以扩大变异范围、改变产品的产量和质量，甚至创造出新产品。包括常规杂交育种，原生质体融合，转导育种，转化育种等。二、微生物分子育种技术（一）重组DNA技术：也称基因克隆，是将一个含目的基因的DNA片段经体外操作与载体连接，并转入到受体细胞，使之在受体细胞内扩增、表达的操作过程。操作过程通常包括以下步骤:含目的基因的DNA片段的分离与制备；载体的构建；含目的基因的

3、DNA片段与载体相连接；将重组分子送入受体细胞，并在其中复制、扩增；筛选带有重组DNA分子的转化细胞；鉴定外源基因的表达产物。重组DNA技术实施的4个必要条件：工具酶，基因，载体和受体细胞。（二）定向进化：是指在试管中进行的“分子进化”，即在实验室人工控制的条件下模拟和加速生物分子向特定目标进化的过程。其对象可以是蛋白质或多肽，也可以是核酸和其他大分子，甚至是一些生物体中的小分子。通过人工合成或借助于重组DNA技术，人为地制造大量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力；或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛选出来。其过程包括构建文库和筛选两部分。（三）基因组重排：该技术可看成是

4、一种细胞水平的体内定向进化技术，可用来改造细菌的基因组，实现表型的改良。经典杂交技术在每一代只有两个亲本进行重组，而重排技术则具有多亲本杂交的优势，对细菌群体进行重复的基因组重排可以有效构建新菌株的组合文库。（四）代谢工程：利用DNA重组技术修饰细胞中特定生物化学反应（代谢途径）或引入新的生物化学反应，以提高特定代谢物的产量或改善细胞的其他性能的学科。应用领域主要有：提高细胞已有的化学物质的产量；产生宿主细胞本身不能合成的新物质；扩展细胞的底物使用范围；形成降解毒性物质的新催化活性；修饰细胞的其他生物学特性。 采取的策略主要有：在现存途径中提高目标产物的代谢流；在现存途径中改变其物质流的性质；

5、利用已有途径构建新的代谢旁路。2、你认为与工业微生物育种有关的最重要发现或发明有哪些？为什么？（1）1684年，列文虎克发现细菌：只有发现了微生物的存在，才能有后来的一系列研究和发现，为其提供进一步研究的前提和基础条件（2）1881年，科赫研究纯培养细菌的方法：纯培养方法的建立，使需要的目的菌株能从混杂的微生物中分离出来，为对其进行专一的研究提供了方便，并且为纯种发酵提供了理论依据。以纯培养的方式分离出能制造有用物质的细菌和真菌，才开始有可能选出适用于特定需要的菌株，这是对微生物控制及改良的起步。（3）1929年，弗莱明发现青霉素：青霉素的发现及其大容量的市场需求促进了相应发酵行业多方面的发展

6、，也促使人们对发酵机理进行更多的研究，并不断选育更优良的生产菌株，促使工业育种的发展（4）1940年，发现红色脉孢菌的突变，及1943年细菌的突变：突变的发现，促进了以后对微生物突变机制的研究，为遗传物质的发现提供了起点，也为诱变育种提供了事实材料和理论基础（5）1944年，证明DNA是遗传物质：发现DNA是遗传物质，是遗传学里的一项重大突破，为后来的诱变育种、基因重组育种、基因工程等准备了理论基础（6）1953年，沃森和克里克发现了基因的结构：基因结构的发现，不但使人们清楚了基因的结构，促进了遗传学的发展，也为在分子水平上改造微生物的遗传物质以获得具有优良生产性能的菌株提供了条件，试可行的基

7、因改造成为可能（7）1977年DNA序列分析，及1988年PCR反应：DNA序列分析和 PCR反应，为分子水平上进行研究和育种工作提供了方便有效的实用方法和手段（8）1995年细菌基因组的完整序列，及1999年百余种微生物基因组序列的测定：为我们进行微生物遗传物质和机理的研究提供了丰富的材料和数据，为重组和基因工程育种提供了更多知识背景和研究素材，促进新的育种方法的开发3、名词解释：染色体、基因、基因型、表现型染色体：细胞核内由核蛋白组成、能用碱性染料染色、有结构的线状体，是遗传物质基因的载体。对于原核生物来讲，由于它没有严格意义上的细胞核，只有称为拟核的区域，位于其中的遗传物质也通常被称为染

8、色体。基因：是含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位，在染色体上呈线状排列，也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。基因型：基因型是指生物的遗传型，是生物体从它的亲本获得全部基因的总和，即它的全套DNA。一个微生物的基因型由它的遗传信息组成，它编码微生物的所有特性，基因型代表潜在的特性，但并不是特性本身。表现型：是与基因型相对应的概念，表现型是一个生物体的实际外表特征如大小、重量、颜色等。表现型主要受生物的基因型和环境影响。表现型是基因型的表现。从某种意义上说，微生物的表现型是它蛋白质的总和。4、突

9、变类型及对表型的影响。、从DNA碱基顺序改变来分，突变一般可分为碱基置换突变、移码突变、整码突变及染色体错误配对和不等交换4种。（1）碱基置换突变：一个碱基被另一碱基取代而造成的突变称为碱基置换突变，包括转换和颠换。碱基置换会导致蛋白一级结构氨基酸组成的改变而影响蛋白质酶生物的功能。由于碱基置换导致核苷酸顺序的改变，对多肽链中氨基酸顺序的影响，有下列几种类型；如果突变后的密码子编码的仍是同一种氨基酸，则称为同义突变如果突变后的密码子编码的是不同的另外一种氨基酸，则称错义突变如果突变后的密码子是终止密码子，则叫无义突变当DNA分子中一个终止密码发生突变，成为编码氨基酸的密码子时，多肽链的合成将继

10、续进行下去，肽链延长直到遇到下一个终止密码子时方停止，因而形成了延长的异常肽链，这种突变称为终止密码突变，也叫延长突变。当基因内部不同位置上的不同碱基发生了两次突变，其中一次抑制了另一次突变的遗传效应，这种突变称为抑制基因突变。（2）移码突变：在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸（但不是三联体密码子及其倍数）的插入或缺失而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和翻译错误的突变称为移码突变。一般只引起一个基因的表达出现错误，增加或减少12个碱基会使该位点后面的RNA序列发生移码，产生无功能的蛋白质。移码突变造成的肽链延长或缩短，取决于移码终止密码子推后或提前出现。（3）整码突变：如

11、果在DNA链的密码子之间插入或丢失一个或几个密码子，则合成的肽链将增加或减少一个或几个氨基酸，但插入或丢失部位的前后氨基酸顺序不变，称为整码突变或密码子插入或丢失。（4）染色体错误配对不等交换：减数分裂期间，同源染色体间的同源部分发生联会和交换，如果联会时配对不精确，会发生不等交换，造成一部分基因缺失和部分基因重复。这种突变常用解释大段多核苷酸的丢失和重复。、从突变的表现型可将突变分为形态突变、生化突变、致死突变和条件致死突变四类：(1)形态突变型：指突变的菌体发生形态可见的变化。如细胞大小、形状、鞭毛、芽孢、荚膜，以及群体形态结构（菌落和噬菌斑等）的改变。(2)生化突变型：指突变的菌体原有特

12、定的生化功能发生改变或丧失，但在形态上不一定有可见的变化，通过生化方法可以检测到。如菌体对底物的利用能力、对营养物的需求、对过量代谢产物或代谢产物结构类似物的耐性以及对抗药性发生的变化。另外，也包括细胞成分尤其是细胞表面成分（细胞壁、荚膜及鞭毛等）的细微变异而引起抗原性变化的突变。(3)致死突变型：突变造成菌体死亡或生活能力下降。致死突变若是隐性基因决定的，那么双倍体生物能够以杂合子的形式存活下来，一旦形成纯合子，则发生死亡。(4)条件致死突变型 突变后的菌体在某些条件下，可以生存，但在另一些条件下则发生死亡。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。有些菌体发生突变后对温度变得敏感了，在较窄的

13、温度范围内才能存活，超出此温度范围则死亡。其原因是有些酶蛋白（DNA聚合酶，氨基酸活化酶等）肽链中的几个氨基酸被更换，从而降低了原有的抗热性。5. 简述野生型菌株的分离与筛选的步骤基本步骤如下：调查研究（包括查阅资料）实验方案设计（确定采样的生态环境）采样增殖培养平板分离根据实际情况进行定性或半定量测定初筛：一株一瓶复筛：一株3-5瓶第四次平板分离第四次原种斜面再复筛（初步工艺条件摸索）较优菌株1-3株保藏(1)收集微生物资源（采样）：用于分离微生物的样品通常为土样、植被和植物瓜果等。为了尽可能的涵盖各类微生物，要在广阔的、分散的地点多点采集样品，最好是不同的大陆地理带和进化带，这将会进一步增

14、加微生物的种类。采土样时，应取离地面5-15cm处的土，并尽快分离。(2)增殖培养：为了提高样品中目的菌的数量和比例，需要进行增殖培养，主要通过控制营养成分、培养基的酸碱度和培养温度，以及热处理和添加抑制剂等方法。(3)纯种分离：为了将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养，需要进行纯种分离，主要有涂布平板分离法、倾注平板分离法、平板划线分离法和组织分离法。纯种分离时可以根据菌种特性采用一些平皿反应快速检出法，如透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑菌圈法纸片培养显色法等。（4）初筛：是指对具有潜在工业应用价值的微生物的检测和分离，理想的初筛方法应快速、灵敏、经济。初筛以量为主，对所分离的菌株进

15、行略粗放的生产性能测试。初筛也用到根据菌种特性的一些平皿反应快速检出法，另外还有纸条法、浓度梯度平皿检测法等。（5）复筛：是进一步挑出那些确实有工业应用价值的微生物，排除那些不具有潜力的微生物。复筛以质为主，对经初筛所获得的少量生产潜力较大的菌株进行比较精确的生产性能测试，并考察产量的稳定性。复筛可反复进行多次，直至选出最优的1-3株。6简述选择性培养基在育种中的应用及富集培养基在育种中的作用选择性培养基：是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来，但这种富集和选择性是相对的，在这种培养基上生长的微生

16、物并不是一个纯种。作用：利用这类培养基可以从杂居多种微生物的样品中较容易的分离出目的被标记有特殊生理性能的微生物，若能将培养基的营养成分与培养的环境条件（如通气、温度、渗透压等）结合起来，分离效果更佳。富集培养基：是为分离某类微生物而加入助长该类微生物的营养物质或加入抑制其他微生物生长的抑菌剂的培养基。作用：可以通过富集将目的微生物的数量增大，以便进一步进行分离。主要是根据不同种类微生物对碳氮源、PH、温度、需氧等生理因素的要求不同进行控制，以达到分离纯化的目的。富集培养对于那些样品中含有的微生物数量较少的样品是必须的，但如果按照通常分离方法即能得到足够数量的微生物，则不必进行富集培养，可以直

17、接进行分离纯化。7、经典基因重组的方法有哪些？遗传物质的传递有什么不同？ 一、同源重组：发生在同源序列间的重组，又称基本重组，是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接。在真核生物减数分裂中发生的同源重组是一种交互重组；在细菌的转化、接合和普遍性转导中所发生的同源重组是一种单向重组，即仅受体发生重组，供体并未发生改变。（1）真核生物中，两个DNA分子同源序列间单链或双链片段的交换。 对于有性生殖的霉菌和酵母：主要通过两个有性孢子之间的结合，在减数分裂过程中实现涉及整个染色体组的基因重组。对于不进行典型有性生殖的某些霉菌：可以在准性生殖过程中实现基因重组，通过两个体细胞之间的结合，在有丝分裂

18、过程中实现涉及整个染色体组的基因重组。（2）原核微生物的基因转移与重组：细菌的接合：主要存在于大肠杆菌等菌中，在供体、受体细菌细胞的暂时沟通中，受体菌接受供体菌的部分染色体形成局部合子，通过染色体的双交换而实现基因重组。结合需要一种松弛型的环状DNA质粒作为介质，结合需要细胞间的直接接触，并且接合细胞必须具备相对的接合型。转导：以噬菌体为媒介而将供体菌的个别或少数基因传递给受体菌，然后在受体菌中实现基因重组。转导分两步，首先噬菌体感染细菌，细菌裂解释放出携带有供体菌染色体基因的转导噬菌体，转导噬菌体感染受体菌，将所携带的供体染色体基因传递到受体菌内。包括普遍性转导和局限性转导，前者只能传递供体

19、细菌染色体上原噬菌体整合位点附近少数基因的转导，后者则能传递供体细菌染色体上任何基因的转导。转化：受体菌直接吸收供体菌的游离DNA，并将其整合到自己烦人染色体基因组中发生基因重组而获得后者遗传性状的现象。二、位点特异性重组：发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列，供重组蛋白识别。最典型的位点特异性重组是噬菌体在att位点整合到E.coli的基因组中。三、转座重组：转座是重组的特殊类型，是由转座子产生的特殊行为。转座的机制依赖于DNA的交错切割和复制，不依赖于同源序列。四、原生质体融合：指用物理、化学或生物学的方法，促进两亲株原生质体融合，经过染色体交换、重组而达到杂交目的，通过筛选获得集两亲

20、株优良性状于一体的稳定融合子的过程。与常规的基因重组相比，基因重组的频率提高，重组的亲本范围扩大、融合子集中两亲本优良性状的机会增大。8、质粒和转座子的定义和作用（1）质粒：细胞染色体或核区DNA外能自主复制的小型DNA环状分子，大小约为2200kb，通常以多拷贝形式存在于宿主细胞中。虽然质粒的正常复制依赖宿主细胞中的聚合酶及其他成分，但它含有复制起点，用于保证其自主复制。质粒一般仅携有几个基因，其中之一会赋予细菌对抗生素物质的抗性。大多存在于细菌中，真核生物如酿酒酵母中也有发现。作用：质粒通常是非必需的，但在特定条件下，质粒携带的基因对于细胞的生存和生长十分关键。某些质粒赋予微生物特殊的能力

21、使其能够在十分复杂恶劣的环境中生存；有些质粒编码的蛋白可以增加细菌的致病性；R因子是充当基因传递介质的质粒，它携带的基因赋予宿主细胞对抗生素、重金属和细胞毒素的抗性；质粒是一种重要的基因工程工具，常用人工构建的质粒作为载体。（2）转座子：是一种能在DNA分子不同区域之间进行移动（称为“转座”）的小片段DNA，又称为跳跃基因，大小约为700-40000bp。分为两类：编码自身扩增酶系的DNA转座子；来自逆转录病毒的DNA逆转录拷贝。作用：转座子介导的基因转移过程在原核生物和真核生物中普遍存在，并通过缺失、插入、移动、交换等形式直接或间接地促进基因组重排事件的发生。因此在代谢工程操作中，常将外源基

22、因插在转座子内部，利用所形成的重组转座子将外源基因带到宿主细胞染色体的某些位点上。转座子具有能将基因在染色体间移动的强大自然机制。另外，由于质粒或病毒能携带转座子在细胞间传递，所以转座子可在生物体甚至种属间转移，可见转座子是一种有潜能的生物进化介质。9、简述PCR扩增特定基因序列的原理？PCR注意事项有哪些？（1）PCR的全称是聚合酶链式反应，是一种体外在DNA聚合酶催化下、通过两条人工合成的单链引物的引导而扩增模板DNA分子上两引物序列之间DNA片段的方法。PCR技术最基本的应用是从大量DNA中将已知序列的目标基因的拷贝数极大提高，以便将其分离出来；还可以用于克隆新基因和基因的改造，并广泛应

23、用于疾病检测、司法鉴定等许多领域。（2）基本过程及原理：首先针对已知序列的目标基因，设计一对引物。每一条引物的序列分别与目标DNA双链的一条链的3端互补。PCR反应一个循环的第一步是高温变性，在95下目标基因所在的DNA片段双链分开成为单链。第二步是复性，即体系温度降低，DNA双链又重新结合为双链，在反应体系中，引物的拷贝数远远超过模板的拷贝数，因此目标基因复性时，其两端首先和引物结合为双链，复性温度因引物和实验目的不同而变化，一般为4070，以5060最常见。第三步是链的延伸，体系温度升到72，这是耐热DNA聚合酶作用的最适温度，从引物的3端开始合成DNA链。一次PCR反应多为25-35个循

24、环。(3)注意事项：1：避免交叉污染勤换枪头和高压枪头和PCR管。2：引物设计要正确，选择可靠的生物公司合成引物3：DNA提取要成功。4：引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量会抑制体系的反应。5：跑胶时注意区分开EB污染区和清洁区。6：配制的时候需要充分混匀，比如溶解引物，需要先混匀再分装。还有DNA提取之后最好4度过夜之后再做PCR，这有利于DNA的充分溶解。10.目的工业微生物应具备的特性及其获得的一般途径？（1）目的工业微生物应具备的特性：菌株遗传稳定性好，可长期保存；易于产生大量营养细胞、孢子或其它繁殖体，在种子罐和其它用于制备大量种子的容器中培养时能够茁壮、快速繁殖；必须是纯培

25、养物，不含有其它微生物和噬菌体；种子的生长必须旺盛、迅速；菌株在较短的时间，一般在3d或更短的时间内能快速产生目的产物，并很少产生毒性物质或副产物；比较容易分离纯化菌株具有抵制其它杂菌感染和忍受不良环境的能力，这种自我保护表现为pH值的降低，在较高的温度生长，或对高浓度代谢产物的忍耐力；能保持较长的良好经济性能；对诱变剂敏感，可通过诱变达到提高菌种性能的目的；在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定（2）目的工业微生物获得的一般途径：在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的来说可以从以下几个途径进行收集和筛选：向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。国内外

26、著名的菌种保藏机构有：中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM），美国典型菌种保藏中心（ATCC），英国国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统的产品中容易筛选到理想的菌株。11、简述微生物代谢产物的平板检测方法用于菌种筛选的原理及应用范围。平板检测方法即根据分离培养基上的特异反应来挑选目的菌的一种快速、简捷的方法。其依据是检测单菌落是否产自目的产物并对目的

27、产物的产量进行粗略估计。通过观察微生物在特殊分离培养基上的生长情况或生化反应进行分离，可显著提高目的微生物分离纯化的效率。主要有以下几种快速检出方法，各自筛选的原理和应用范围如下：纸片培养显色法：将适量细胞悬浮液接种于饱浸含有某种指示剂的固体培养基的滤纸上培养，得到分散的单菌落，菌落周围形成对应的颜色变化，指示剂变色圈与菌落直径之比值大者表示产物的产量高，由此可挑选产量较高的菌株。可以检出与指示剂反应产生有色物质的产生菌。透明圈法：利用混浊的底物被分解后形成的透明圈的大小，可检出微生物分解利用此物质的能力。该法多用于分离水解酶产生菌，如以淀粉为碳源的培养基可鉴别菌落能否产生淀粉酶；以纤维素为碳

28、源的培养基可鉴别菌落能否产生纤维素酶；以酪蛋白为氮源的培养基可鉴别菌落能否产生蛋白酶。也可分离产有机酸的微生物，在分离培养基中加碳酸钙形成浑浊状，涂布平板培养后，产酸菌落四周的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈法。变色圈法：直接用显色剂或指示剂掺入培养基中，或喷洒至已形成菌落的培养基的表面，根据显色圈或变色圈等形成而对目的菌进行检出。稀碘液与培养基中的可溶性淀粉及其不同长度的分解产物结合可呈蓝色、棕色、红棕色乃至无色，由变色圈的颜色及大小可粗略知道某菌落所分泌淀粉酶的种类及能力。刚果红与葡聚糖、羧甲基几丁质等多糖结合呈红色，可用于检出葡聚糖酶、几丁质酶等多糖降解酶的产生菌。生长圈法：生长圈法是根据工

29、具菌在目的菌周围形成生长圈对目的菌进行检出。常用于检出氨基酸、核苷酸以及维生素等产生菌。所用工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待分离菌株涂布与高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，则在能合成该营养物的菌落周围会产生一个浑浊的生长圈。抑菌圈法：抑菌圈法是根据工具菌在目的菌周围的生长被抑制而形成一个抑菌圈而对目的菌进行检出。常用于抗生素产生菌的分离和筛选。所用工具菌为抗生素的敏感菌。若被分离微生物能产生某种抗生素，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。利用抑菌圈法还能筛选产生某些酶类的微生物。如可利用抑菌圈法筛选青霉素酰化酶产生菌。工具菌为一种对苄青霉素抗性而对6-氨基青霉烷酸

30、（6-APA）敏感的黏性沙雷氏菌。将工具菌和苄青霉素混合于平板培养基中，将待分离菌涂布于平皿上培养，凡菌落周围出现抑菌圈的即为青霉素酰化酶产生菌。12 如何进行抗性菌株的筛选有两种方法：一次性筛选法；阶梯性筛选法（1）一次性筛选法：在对于出发菌株完全致死的环境中一次性筛选少数抗性突变株的方法。在筛选抗性突变株时，首先要测定药物对出发菌株的临界致死浓度。然后将经过后培养的细胞以较高的密度涂布或倾注到含有高于临界致死浓度药物的平板上，经培养后长出的菌落即为抗性突变株。抗噬菌体突变株常用一次性筛选法进行筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经过诱变处理和后培养后，大量接种含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌

31、不能生存，应使噬菌体数多于细胞数，此时可确保敏感菌株完全致死，只有突变株能在此环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离该培养液，即可获得纯的抗噬菌体突变株。（2）阶梯性筛选法：使用药物浓度梯度平板筛选在对敏感菌致死的药物浓度区生长的抗性突变株的方法。梯度平板法：在培养皿中倾注7-10mL不含药物的琼脂培养基，将培养皿一侧搁置在木条上，使培养基形成的斜面刚好完全覆盖培养皿的底部。待培养基凝固后将培养皿放平，再倾注7-10mL含有一定浓度药物的琼脂培养基，也使之刚好完全覆盖下层培养基，凝固并放置过夜。由于药物在上下层培养基之间的扩散作用，在平板内形成了随上层培养基由厚到薄的药物浓度梯度。将经过后

32、培养的细胞涂布此平板，经培养后会逆药物的浓度梯度形成菌落的密度梯度。在低药物浓度区，细胞大量生长，形成厚厚的菌苔;高药物浓度区，菌落数逐渐减少。在菌落的稀少及几乎空白区域长出的少数菌落即为抗性突变株。另一种方法是将固体药物直接加到涂有菌的平板表面，在培养过程中，药物逐渐溶解并向周围扩散，形成一个以固体药物为中心的药物浓度梯度。经培养后，能看到固体药物的周围有一个明显的抑菌圈，存在清晰或模糊的边缘，在抑菌圈区域长出的少数菌落即为抗药性菌株。纸片扩散法：在无菌滤纸片上加入一定量的药物，干燥后放入涂布菌体的平板上，在抑菌圈内长出的菌为抗性菌，越接近药物抗性越强。13、诱变菌悬液的制备要考虑哪些因素？

33、为什么要这样制备菌悬液？对于诱变菌悬液的制备，需从三方面加以考虑：选择合适的介质。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲液制备，特别是用化学因素处理的，要用缓冲液，因很多化学诱变剂需要在一定的pH值环境中才能发挥作用，而且在处理过程中pH值也会变动。使细菌或孢子要处于良好的分散状态。使细菌分散均匀的方法是先用玻璃珠振荡分散，然后再用脱脂棉或过滤纸过滤。对于酵母等个体较大的细胞，可以换用两层擦镜纸过滤，经过如此处理，分散度可达90%以上，供诱变处理较为合适。调节适当的细胞或孢子浓度。一般处理真菌孢子或酵母细胞悬浮液的浓度大约为106-1010个/mL。放线菌或细菌密度大些，可在108个/mL左右。悬浮液的

34、细胞数可用平板菌落计数法估计活菌数，也可用血球计数器或光密度法测定细胞总数，其中以活菌计数较为准确。另外，细胞要求同步，并且处理的细胞的菌龄是在生理活性最旺盛的对数期。这时细胞遗传性状稳定，对诱变剂敏感，突变率高，重现性也好。用单细胞菌悬液诱变处理的理由是：如果几个细胞在一起，诱变时受的剂量不均匀，几个细胞变异情况不一致，长出的菌落就有几种状态的细胞，每批、每代筛选结果将产生很大差异，给筛选造成很大麻烦，不能将真正的菌种筛选出来。具体制备方法：取新鲜的斜面培养物，加入无菌生理盐水或无菌水，将斜面孢子或菌体刮下，然后倒入装有玻璃珠的三角瓶中振荡，再用滤纸或药棉过滤，既可以得到单孢子或单细胞菌悬液

35、。14. 简述工业微生物诱变育种程序是什么？诱变育种的工作程序如下：出发菌株-分离纯化、筛选-斜面-同步培养-离心洗涤-玻璃珠振荡打散-过滤-单细胞或孢子悬浮液-诱变处理-后培养-平板分离-斜面-初筛-复筛-分离筛选-保藏及扩大试验诱变菌种的基本步骤：出发菌株的选择，诱变菌株的培养，诱变菌悬液的制备，诱变处理，后培养，突变株的分离与筛选等。出发菌株的选择：出发菌株应对诱变剂的敏感性强，变异幅度大。用作出发菌株的菌常有以下几类。第一类是从自然界分离的野生型菌株。第二类是诱变育种中常采用的，对在生产中自发突变而经筛选得到的菌株进行诱变。这类菌株类似野生型菌株，容易得到好的效果。第三类是对已经诱变过

36、的菌株进行再诱变。作为出发菌株，必须具有合成目的产物的代谢途径。这在选育氨基酸和核苷酸类的生产菌时尤为重要。另外，出发菌最好是单倍体的单核细胞。诱变菌株的培养：若出发菌株是细胞或酵母菌等单细胞微生物，一般采用营养细胞进行诱变处理。其目的是将诱变细胞的生理状态调整到处于同步生长状态的旺盛的对数生长期，而细胞内又含有丰富的内源性碱基。对于丝状菌，一般取其孢子进行处理，因为多数丝状菌的孢子是单核，经诱变处理后不易发生分离现象。诱变菌悬液的制备诱变处理：诱变处理包括三方面内容：诱变剂的选择，剂量的选择，诱变处理方式。诱变剂有化学诱变剂和物理诱变剂两种。化学诱变剂如甲基磺酸乙酯、亚硝基胍等。物理诱变剂如

37、紫外线，离子束，电离辐射等。目前处理剂量已从以前采用的致死率90%-99.9%的剂量降低到致死率为70%-80%，甚至更低的剂量，特别是对于高产菌株更偏低。对于多核细胞或孢子来说，则宜采用较高的诱变剂量。诱变处理方式有单一诱变处理、复合处理、不同诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理以及紫外线与光复活交替处理等。后培养：诱变处理后，立即将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯合并表达。后培养所用的培养基的营养一定要丰富，必须含有足量的氨基酸和嘌呤嘧啶碱基。突变株的分离与筛选：筛选工作分为初筛和复筛。初筛在初筛阶段，要在工作条件固定的情况下，尽快地把较多的菌株筛选完。复筛时

38、为了更有效地获得生产用菌株，还可参照生产的工艺条件来就进行试验。15、如何选用诱变剂与诱变方法？（1）诱变剂的选择：根据诱变剂作用的特异性来选择诱变剂 选择诱变剂要注意，诱变剂主要是对DNA分子上的某些位点发生作用，如紫外线的作用主要是形成嘧啶二聚体；亚硝酸主要作用于碱基上，脱去氨基变成酮基；碱基类似物主要取代DNA分子中的碱基；烷化剂亚硝基胍对诱发营养缺陷型效果较好；移码诱变剂诱发质粒脱落效果较好。根据菌种的特性和遗传稳定性来选择诱变剂 对遗传稳定的菌种，可以采用尚未使用过的、诱变谱宽、诱变率高的强诱变剂；对遗传性不稳定的菌种，可以先进行自然选育，然后采用缓和的诱变剂进行诱变处理。对经过长期

39、诱变后的高产菌株，以及遗传性不太稳定的菌株，宜采用较缓和的诱变剂和低剂量处理。选择诱变剂和诱变剂量，还要考虑选育的目的。筛选具有特殊特性的菌种或要较大幅度提高产量，宜采用强诱变剂和高剂量处理。对诱变史短的野生型低产菌株，开始时宜采用强诱变剂、高剂量处理，然后逐步使用较温和诱变剂或低剂量进行处理。参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂 诱变之前要考察出发君主的诱变系谱，详细分析、总结规律。要选择一种最佳的诱变剂，同时要避免长期用同一种诱变剂。（2）诱变方法的选择：诱变剂的处理方式有单因子处理和复合因子处理两种方式。单因子处理指采用单一诱变剂处理出发菌株；而复合因子处理指两种以上的诱变剂诱发菌体突

40、变。复合因子处理又可分为如下几种方式：两个以上因子同时处理；不同诱变剂交替处理；同一诱变剂连续重复使用；紫外线光复活交替处理。复合因子处理时需要考虑两个问题，即诱变剂处理时间与诱变效应的关系以及诱变剂处理先后和协同效应问题。一般来说，低浓度长时间处理较高剂量短时间处理效果好；先用弱诱变因子后用强诱变因子往往是比较有效的。另外，诱变剂的处理方式也可分为直接处理方法和生长过程处理方法。直接处理方法是指先对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离突变株。生长过程处理方法适用于某些诱变率强而杀菌率低的诱变剂，或只对分裂DNA起作用的诱变剂。生长过程处理方法通常采用以下几种做法：一是将诱变剂假如培养基中涂平

41、板；二是现将培养基制成平板，再将诱变剂和菌体加入平板；三是摇瓶振荡培养处理，即在摇瓶培养基中加入诱变剂，经摇瓶培养后涂平板。16、举例特殊性能变异株的初筛方案.（1）定向筛选组氨酸营养缺陷型突变菌株菌种：北京棒杆菌；培养基：完全培养基（C.M.）、基本培养基（M.M.）、种子培养基（S.M.）、无氮基本培养基、二倍氮源高渗培养基、补充培养基 （M.M.+His）方法：青霉素法定向筛选 His- 菌株NTG诱变：将对数生长前期的种子液离心、洗涤 3 次 ,打散至分散度高于 90%,用pH6.98的磷酸缓冲液悬浮至菌浓约 108 109 /ml,转入已配制好的NTG溶液中 ,至NTG浓度为0.25

42、mg/ml、菌浓为 10 8/ml,2830 水浴锅中诱变 30min(致死曲线已作) ,离心、洗涤 3 次 ,悬浮菌体 ,待用NTG有剧毒 ,操作时注意防护 ,实验结束后要妥善处理染毒器物 ,保障他人安全。中间培养：将以上所得菌液以 5%接种量，接入 MM+His 100 ug/ml 培养基 ,28 下于 220rpm培养 68h,使细胞分裂几代 ,以排除表型延迟对实验结果的干扰 ,使得营养缺陷突变型表型充分表现出来。饥饿培养：将以上菌液离心、洗涤 2 次后转接（接种量 10%） 至无氮基本培养基中培养至菌浓基本不再增加 （根据 O.D.600nm 判断）,以消耗菌体残留的氮源 尤其是氨基酸

43、类氮源 青霉素处理前的培养及青霉素处理：向以上培养液中补加等体积的二倍氮源基本培养基 ,该培养基中含 20%葡萄糖、100 ug/ml 氨基酸混合液（除组氨酸外）和0.02M的Mg2SO4，28 下于 220rpm培养至菌浓加倍 ,使得原养型菌株生长至对数期;向其中加入青霉素溶液，至最终浓度为 2000 单位/ml,置 28 水浴锅中静置保温处理 ,不时轻轻摇动 ,每 30min 镜检一次 ,至约有 50%60%细胞变为原生质体时 ,离心、洗涤 3 次 ,以停止青霉素的作用 ,使得原生质体破裂并洗去因原生质体涨破而释放出的营养物质;所得菌液稀释涂布 MM+His平板 ,余者待用。青霉素处理后的

44、浓缩培养：以上菌液接MM+His（ 100 ug/ml ）,培养 68h,使得 His- 细胞（以及残余原养型细胞） 增殖 ,所得培养物离心、洗涤2 次以除去残存组氨酸，稀释涂布 MM+His平板。His- 突变株的筛选：将 MM+His 平板上长出的菌落一一对应 ,先后点种至 MM 和 MM+His （100 ug/ml ）平板上 ,挑选前者上不生长而后者上生长的菌落，复检 ,鉴定 His- 突变株。（2）代谢类似物的梯度培养筛选所谓代谢类似物是一些和生物体内的氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等化合物分子结构相类似的药物，这些药物一般具有抑制细胞生长的作用。上述氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶等是一些微

45、生物的代谢产物，由于本身的代谢调节作用，这些物质在生物体内的浓度过高时，会抑制微生物继续积累这些物质，即反馈抑制。如果选取抗代谢类似物的突变株，就可提高相应代谢产物的产量。例如，吡哆醇是酵母菌的代谢产物之一，但产量不高。异烟肼与吡哆醇具有相似的分子结构，对于微生物有抑制作用，选取抗异烟肼的突变菌株就可以得到产吡哆醇的菌株。在具体工作中，可采用梯度培养发使选种工作进一步简化。具体做法是在培养基中加入10mL普通培养基并把培养基斜放，待凝固后经培养皿放平，再在其上加入10mL含有一定量异烟肼的培养基，这样异烟肼的浓度在培养基内是以梯度存在的。在培养皿表面涂布诱变后的细胞悬浮液，经培养，异烟肼浓度较

46、高的部分，酵母几乎全部被抑制。出现少数抗异烟肼细胞所形成的菌落。在酵母菌中，用此法曾获得吡哆醇产量提高7倍的突变菌株。（3）高分子废弃物分解菌的阶梯式筛选由于高分子化合物在各方面应用越来越广泛，废弃的合成树脂、合成纤维也大量增加，污染问题越见严重。由于合成树脂、合成纤维多半不溶于水，要把他们做成培养基，从土壤中直接分离到这类分解菌是困难的。但已经设计了阶梯式筛筛选方法，并在某些方面已经获得成果。例如，为了得到能分解聚乙二醇等物质的变异株，首先从土壤中分离出能在与聚乙二醇结构相似的三甘醇上生长的菌。由于高分子一般是单一结构的重复，所以可考虑采用能利用其结构单位生长的菌，再进行诱变而达到目的。实际

47、上，从原来不能利用1，2-丙二醇作为唯一碳源的大肠杆菌，用EMS诱变，再培养在含0.2%丙三醇的琼脂培养基上得到菌落。经分析证实，它较出发菌株多产一种酶。这种酶对乙二醇、1，2-丙二醇和乙醇具有活性，使得突变株能利用乙二醇、丙二醇等为唯一碳源。在此基础上再进行诱变，就可获得能利用聚乙二醇的突变株17.代谢调控育种的基础与方法有哪些?代谢调控育种是通过遗传变异来改变微生物的正常代谢，使某种代谢产物形成和积累。在代谢调节控制育种中通过特定突变型的选育，人为地打破微生物细胞内代谢的自动调节，改变代谢流向，减少或切断支路代谢产物的形成以及提高细胞膜的通透性，使目的代谢产物大量累积。从细胞生理的角度上看

48、选育获得的都是代谢异常的突变株。微生物代谢调控育种的措施很多，主要包括以下几种：营养缺陷型突变，渗漏营养缺陷突变，营养缺陷回复突变，结构类似物抗性突变等的筛选。18.筛选营养缺陷型菌株在操作上应注意什么？配制培养基及试剂时所用水必须为不含杂质或其他微量元素的纯净水，培养皿三角瓶等玻璃仪器需用水彻底清洗干净，防止带入杂质影响实验结果。单核细胞在对数生长期，由于细胞分裂，在一个细胞中常常有两个核，若变异发生在一个核上时必须经过一代繁殖，才能把一个变异了的细胞和没有变异的细胞分开。如果是多核细胞，必须繁殖几代，才能把各种类型的核各个分离开来。这种现象对各种细胞都是存在的。为了减少以后筛选中再产生这种分离的混种现象，所以在缺陷型首次分离之前，先进行中间培养是必要的，中间培养用的培养基可以是完全培养基，也可以是补充培养基。淘汰野生型时，浓缩前应在无氮培养基中培养一段时间耗尽细胞内所含的养料，避免在处理期间由于细胞自溶产生的营养物质促进缺陷型细胞的生长。19、配置生长谱测定试剂的注意事项（应该注意不要污染）缺陷型菌株平皿