各种微生物生化试验方法原理.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流各种微生物生化试验方法原理.精品文档.各种微生物生化试验方法原理通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反应，常用于细菌的鉴别。1、 糖类分解产物（1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖

2、只产酸不产气。（2）VP试验（Voges-Proskauer test）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。（3）甲基红试验（methyl red test）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大肠杆菌

3、培养液PH在4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.4以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。（4）枸橼酸盐利用试验(citrate utilization test） 产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。2、蛋白质及氨基酸的分解产物（1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test） 有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸

4、（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。本试验常用于区别肠道杆菌的种类。沙门氏菌属通常为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。（2）明胶液化试验（gelatin liguefaction test） 有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌则不能。（3）吲哚试验（indole test） 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，为吲哚试验阳性。大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；产气杆

5、菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性。吲哚 对二甲基氨基苯甲醛 玫瑰吲哚细菌的生化反应是鉴别细菌的重要手段：其中吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、VP试验(V)和枸橼酸盐利用试验（C），简称为IMVIC试验，常用于大肠杆菌与产气杆菌的鉴别。典型的大肠杆菌的IMViC试验结果为“+-”，而产气杆菌是“-+”。 0票 票数实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术 如何使微生物学技术方法快速、准确、简易和自动化，一直是微生物学工作者研究的热点，尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是时间就是生命。近20多年来，随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，这方

6、面已取得了突破性进展，许多快速、准确、敏感、简易、自动化的方法技术，不仅在微生物鉴定中广为使用，而且在微生物学的其它方面也被采用，推动了微生物学的迅速发展。一、微量多项试验鉴定系统该系统的根本原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定。这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。它是针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量（约0.1ml）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养248小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索

7、表(根据数码分类鉴定的原理编制成)，得到鉴定结果，或将编码输入计算机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。微量多项试验鉴定系统已广泛用于动、植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是临床检验中深受欢迎，迅猛发展。国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；深圳华士达生物科技有限公司的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅

8、里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统：日本的微孔滤膜块等，其中API/ATB包括众多的鉴定系统，共计有750种反应，可鉴定几乎所有常见的细菌。微量多项鉴测技术优点突出，不仅能快速、敏感、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间，缺点是各系统差异较大，有的价格贵，有的个别反应不准，难判定，但毫无疑问，它是微生物技术方法向快速、简易和自动化发展的重要方向之一。API20E系统是API/ATB中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的

9、塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反应，个别的分隔室可进行两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌，如图1所示。图1 API 20E鉴定卡示意图鉴定未知细菌的主要过程：将菌液加入每一个分隔室；培养后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观察鉴定卡上20个分隔室中的反应变色情况，根据反应判定表（表1），判定各项反应是阳性还是阴性反应；按鉴定卡上反应项目从左到右的顺序，每三个反应项目编为一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值，依次是1、2、4，各组中试验结果判定的反应是阳性者记，则写下其所定的数值，反应阴性者记，则写为0，每

10、组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码，表2为举例说明；用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入计算机检索，则能将检验的细菌鉴定出是什么菌种或生物型。表1 API20E反应判定表鉴定卡上的反应项目反 应 结 果 代 号项 目 名 称阴 性阳 性ONPN-半乳糖苷酶无色黄ADH精氨酸水解黄绿红，橘红LDC赖氨酸脱羧黄绿红，橘红ODC鸟氨酸脱羧黄绿红，橘红CIT枸椽酸盐利用黄绿绿蓝H2S产H2S无色黑色沉淀URE尿素酶黄红紫TDA色胺酸脱氨酶黄红紫IND吲哚形成黄绿红VPV.P.试验无色红GEL蛋白酶黑粒黑液GLU葡萄糖产酸蓝黄绿MAN甘露醇产酸蓝黄绿INO肌醇产酸

11、蓝黄绿SOR山梨醇产酸蓝黄绿RHA鼠李糖产酸蓝黄绿SAC蔗糖产酸蓝黄绿MEL密二糖产酸蓝黄绿AMY淀粉产酸蓝黄绿 ARA阿拉伯糖产酸蓝黄绿表2 API20E举例说明项目名称ONPGADHLDCODCCITH 2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARA所定数值12412412412412412412试验结果+-+-+-+记下数值10412000010412412412编 码5305773检索结果5305773 产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）实验五、抗微生物药物敏感性试验一、实验目的抗微生物药物敏感性试验（药敏试验）的主要目的

12、检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供依据。对所有临床分离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。纸片扩散法二、实验原理此法是临床和实验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）所推荐的临床微生物理学室常规开展的药敏试验方法。将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制

13、圈。抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。三、实验器材和试剂1菌种 金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853或临床分离的菌株。2培养基 MH（Mueller-Hintion）琼脂。3试剂 无菌生理盐水，0.5麦氏标准比浊管（McFarland standard，相当于1.5108CFU/ml），抗菌药物纸片：选用直径6.35mm吸水量20l的专用药敏纸片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨苄西林（AMP）、哌拉西林（PIP）、头孢唑啉（FZN）、头

14、孢呋辛（FRX）、头孢他啶（CAZ）、头孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亚胺培南（IMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、复方新诺明（SXT）。4其他 无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。四、方法步骤1菌液制备（1）对数生长法：从琼脂平板上选取至少3-5个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含45ml的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，35孵育2-6h。用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于0.5麦氏标准。（2）直接菌落法：从孵育18-24h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成0.5麦氏标准浊度的悬液。2接种 细菌悬液制

15、备后15min内接种至MH琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。3贴药敏纸片 涂布后的平板在室温下干燥3-5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。4孵育将平板倒置放入35孵箱（苛养菌敏平板应放置于5%-10%CO2环境中），16-18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。五、结果判断抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。根据CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生

16、素是敏感、中介还是耐药。敏感（S）：表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。中介（I）：不是敏感性的度量，而是一个“缓冲区”，用以防止因微小的技术因素失控导致的结果偏差，因而其临床意义是不确定的，故不应作临床报告。耐药（R）：表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。六、药敏试验结果判断注意事项（1）药敏试验的结果容易受培养基、抗菌药物、孵育条件等多种因素影响，实验室开展药敏试验时应定期用标准菌株对上述因素进行质量控制。（2）变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长可以忽略。（3）对于链球菌应检测生长抑制圈而不

17、是溶血抑制圈。对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长，所以抑菌圈直径的检测不考虑细微生长的部分（生长菌苔的20%或以下）而测量比较明显的边缘。（4）对于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺甲唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告，第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。（5）沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性。（6）肠球菌属对头孢菌素类、氨基糖苷类（仅筛选高水平耐药性）、磺胺甲 唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，所以不能报告对这些药物敏感。七、影响药

18、敏结果的因素1.培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。2.细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。3.药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。4.培养时间：一般培养温度和时间为37 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培

19、养基，先置4冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。八、思考题1.操作药敏试验并说出注意事项。2.试述药敏试验的意义？3.如何根据药敏试验的结果选择药物？4.什么叫抑菌圈？如何根据抑菌圈大小判断细菌对药物的敏感度？实验六、微生物的生理生化反应微生物生理生化反应的多样性在自然界产生了两种结果:第一是使自然界的有机分子都有可能得到分解;第二是使不同微生物之间有了互相作用和互相依赖的基础.例如,一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物,或者一种微生物的产物可抑制或杀死另一种微生物.所以微生物的生理生化反应也被作为细菌鉴定和分类的内容。一、大分

20、子物质的水解试验(一)目的要求1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同,从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。(二)基本原理微生物对大分子的淀粉,蛋白质和脂肪不能直接利用,必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等.这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实:淀粉遇碘液会产生蓝色,但细菌水解淀粉的区域,用碘测定不再产生蓝色,表明细菌产生淀粉酶.脂肪

21、水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH,使pH降低,加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色,说明胞外存在着脂肪酶。微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外,当缺乏糖类物质时,亦可用它们作为碳源和能源.明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质,在25以下可维持凝胶状态,以固体形式存在.而在25以上明胶就会液化.有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶,水解这种蛋白质,而使明胶液化,甚至在4仍能保持液化状态。还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶来检测.石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成,是昏浊的蓝色.酪素水解成氨基酸和肽后,培养基就会变得透明.石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵

22、,因为在酸存在下,石蕊会转变为粉红色,而过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成).氨基酸的分解会引起碱性反应,使石蕊变为紫色.此外,某些细菌能还原石蕊,使试管底部变为白色。尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物.尿素酶能分解尿素释放出氨,这是一个分辨细菌很有用的诊断实验.尽管许多微生物都可以产生尿素酶,但它们利用尿素的速度比变形杆菌属(Proteus)的细菌要慢,因此尿素酶试验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员.尿素琼脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚红.酚红在pH6.8时为黄色,而在培养过程中,产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨,使培养基的pH升高,在pH升至8.4

23、时,指示剂就转变为深粉红色。(三)器材1.菌种 枯草芽胞杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),普通变形杆菌。2.培养基 固体油脂培养基,固体淀粉培养基,明胶培养基试管,石蕊牛奶试管,尿素琼脂试管。3.溶液或试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液(Lugols iodine solution)。4.仪器或其他用具 无菌平板,无菌试管,接种环,接种针,试管架。(四)操作步骤l.淀粉水解试验(1)将固体淀粉培养基溶化后冷却至50左右,无菌操作制成平板。(2)用记号笔在平板底部划成四部分。(3)将枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌分别在不

24、同的部分划线接种,在平板的反面分别在四部分写上菌名。(4)将平板倒置在37温箱中培养24h。(5)观察各种细菌的生长情况,将平板打开盖子,滴入少量Lugols碘液于平皿中,轻轻旋转平板,使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈,说明淀粉己被水解,为阳性.透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱,即产生胞外淀粉酶活力的高低。2.油脂水解试验(1)将溶化的固体油脂培养基冷却至50左右时,充分摇荡,使油脂均匀分布.无菌操作倒入平板,待凝。(2)用记号笔在平板底部划成四部分,分别标上菌名。(3)将上述四种菌分别用无菌操作划+字接种于平板的相对应部分的中心。(4)将平板倒置,于37温箱中培养

25、24h。(5)取出平板,观察菌苔颜色,如出现红色斑点说明脂肪水解,为阳性反应。3.明胶水解试验(1)取三支明胶培养基试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。(2)用接种针分别穿刺接种(见图34B)枯草芽抱杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌。(3)将接种后的试管置20中,培养25d。(4)观察明胶液化情况。4.石蕊牛奶试验(1)取两支石蕊牛奶培养基试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。(2)分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。(3)将接种后的试管置35中,培养2448h。(4)观察培养基颜色变化.石蕊在酸性条件下为粉红色,碱性条件下为紫色,而被还原时为白色。5.尿素试验(1)取两支尿素培养基斜面试管,用

26、记号笔标明各管欲接种的菌名。(2)分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。(3)将接种后的试管置35中,培养2448h。(4)观察培养基颜色变化.尿素酶存在时为红色,无尿素酶时应为黄色。(五)实验报告1.结果将结果填入下表,+表示阳性,-表示阴性菌名枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌淀粉水解试验脂肪水解试验明胶液化试验石蕊牛奶试验尿素试验2.思考题(1)你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？(2)不利用碘液,你怎样证明淀粉水解的存在？(3)接种后的明胶试管可以在35培养,在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？(4)解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？(5)为什么尿素试验可用于

27、鉴定Proteus细菌？二、糖发酵试验(一)目的要求1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用2.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法(二)基本原理糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气,不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖.发酵培养基含有蛋白胨,指示剂(溴甲酚紫),倒置的德汉

28、氏小管和不同的糖类.当发酵产酸时,溴甲酚紫指示剂可由紫色(pH6.8)变为黄色(pH5.2).气体的产生可由倒置的德汉氏试管中有无气泡来证明.图.糖发酵试验A. 培养前的情况;B. 培养后产酸不产气; C. 培养后产酸产气(三)器材1.菌种 大肠杆菌,普通变形杆菌斜面各一支。2.培养基 葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支(内装有倒置的德汉氏小试管)。3.仪器或其他用具 试管架,接种环等。(四)操作步骤1.用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。2.取葡萄糖发酵培养基试管3支,分别接入大肠杆菌,普通变形杆菌,第三支不接种,作为照.另取乳糖发酵培养基试管3支,同

29、样分别接入大肠杆菌,普通变形杆菌,第三支不接种,作为对照。在接种后,轻缓摇动试管,使其均匀,防止倒置的小管进入气泡。3.将接种过和作为对照的6支试管均置37培养2448h。4.观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。（五）实验报告1.结果将结果填入下表.+表示产酸或产气,-表示不产酸或不产气糖类发酵大肠杆菌普通变形杆菌对照葡萄糖发酵乳糖发酵2.思考题假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖,发酵试验应该出现什么结果？三、IMViC与硫化氢试验(一)目的要求了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法(二)基本原理IMViC是吲哚(indol test),甲基红(methy1 red

30、 test),伏一普(Voges-Prokauer test)和柠檬酸盐(citrate test)四个试验的缩写,I是在英文中为了发音方便而加上的.这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),多用于水的细菌学检查.大肠杆菌虽非致病菌,但在饮用水中若超过一定数量,则表示受粪便污染.产气肠杆菌也广泛存在于自然界中,因此检查水时要将两者分开，硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验吲哚试验是用来检测吲哚的产生.有些细菌能产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸.吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚.但并非所有微生物都具有分解色

31、氨酸产生吲哚的能力,因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性,产气肠杆菌为阴性。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸,乙酸,乳酸等.当细菌代谢糖产生酸时,培养基就会变酸,使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2),即甲基红反应.尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸,但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的.这两个细菌在培养的早期均产生有机酸,但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4,而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物,如乙醇,丙酮酸等,使pH升至大约6.因此大肠杆菌为阳性反应,产气肠杆菌为阴性反应。伏-普试

32、验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力,如丙酮酸.丙酮酸进行缩合,脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰.二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成红色化合物,即伏-普反应阳性;不产生红色化合物者为阴性反应.有时为了使反应更为明显,可加入少量含胍基的化合物,如肌酸等。柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用.有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源,如产气肠杆菌;而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐,如大肠杆菌.细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后,产生碱性化合物,使培养基的pH升高,当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时,培养基就会由绿色变为深蓝色.溴麝香草酚蓝

33、的指示范围为:pH小于6.0时呈黄色,pH在6.07.0时为绿色,pH大于7.6时呈蓝色. 硫化氢试验是检测硫化氢的产生,也是用于肠道细菌检查的常用生化试验.有些细菌能分解含硫的有机物,如胱氨酸,半胱氨酸,甲硫氨酸等产生硫化氢,硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等,就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。以半胱氨酸为例,其化学反应过程如下:CH2SHCHNH2COOH+H2OCH3COCOOH+H2S+NH3H2S+Pb(CH3COO)2PbS+2CH3COOH(黑色)大肠杆菌为阴性,产气肠杆菌为阳性。(三)器材l.菌种 大肠杆菌,产气肠杆菌。2.培养基 蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基,柠檬酸盐斜

34、面培养基,醋酸铅培养基。在配制柠檬酸盐斜面培养基时,其pH不要偏高,以浅绿色为宜,吲哚试验中用的蛋白胨水培养基中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨,如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨较好。3.溶液或试剂 甲基红指示剂,40%KOH,5%-萘酚,乙醚,吲哚试剂等。(四)操作步骤l.接种与培养(1)用接种针将大肠杆菌,产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中(硫化氢试验),置37培养48h。(2)将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基(吲哚试验),2支葡萄糖蛋白胨水培养基(甲基红试验和伏-普试验),2支柠檬酸盐斜面培养基和2支醋酸铅培养基中,置37培养2d。2.结果观察(1)硫化氢试验 培养48h后观察黑色

35、硫化铅的产生。(2)吲哚试验 于培养2d后的蛋白陈水培养基内加34滴乙醚,摇动数次,静置13min,待乙醚上升后,沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂,在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。配制蛋白胨水培养基,所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的,如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。(3)甲基红试验 培养2d后,将l支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴,培养基变为红色者为阳性,变黄色者为阴性。注意甲基红试剂不要加得太多,以免出现假阳性反应。(4)伏-普试验培养2d后,将另1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入510滴40%KOH,然后加入等量的5%-萘酚溶液,用力振荡,再放入37温箱中保温

36、1530min,以加快反应速度.若培养物呈红色者,为伏-普反应阳性。(5)柠檬酸盐试验培养48h后观察柠檬酸盐叙面培养基上有无细菌生长和是否变色，蓝色为阳性,绿色为阴性。（五）实验报告1.结果将实验结果填入下表.+表示阳性反应,-表示阴性反应. 菌名大肠杆菌产气肠杆菌对 照硫化氢试验吲哚试验甲基红试验柠檬酸盐试验2、思考题(1)讨论IMViC试验在医学检验上的意义.(2)解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理,为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸活性的指示剂,而不用丙酮酸？(3)为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性,而产气肠杆菌为阴性？ 这个试验与伏一普试验最初底物与最终产物有何异同处？ 为什么会出现不同？(4)说明在硫化氢试验中,醋酸铅的作用,可以用哪种化合物代替醋酸铅？