发育3：受精.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流发育3：受精.精品文档.第二章 受精：新生命的开始（Fertilization: Beginning a new organism）受精是两性性细胞（配子 gamete）融合到一起而创造遗传了父母双亲基因组的新生命个体的过程。受精使两个终端性（来自父母双亲的基因的联合）和繁殖（创造一个新的有机体）-连接到一起。因此，受精的第一个功能是将父母的基因传递到后代；第二个功能是启动卵子细胞质的反应而使发育进行。虽然受精的细节在不同种动物存在差异，但基本内容包括如下四个主要的事件：1、 精子与卵子的接触和识别。大多数情况下，这能保障受精的精子和卵子来自

2、于同一个物种。2、 精子入卵的调节。最终只能有一个精子能与卵子受精。这通常是通过只允许一个精子进入卵子和阻止其它精子进入来完成。3、 卵子的激活、调整和发育的启动。4、 精子和卵子遗传物质的结合以形成合子。配子的结构（structure of the gametes）卵子和精子之间存在复杂的对话。卵子激活精子的代谢对受精是必须的，精子反过来通过激活卵子的代谢而启动卵子的发育。但在我们研究受精的这些方面之前，我们需要了解为受精而特化的两种细胞类型-精子和卵子的结构。精子的结构每个精子都有一个单倍体的核，一个使核运动的推进系统，和一个能使核进入卵子的酶囊。精子细胞质的大部分都在精子变态时被除去了，

3、只留下一些被调整了的细胞器以行使精子功能。（Fig.7.2）。在精子成熟的过程中，精子核变为流线型，其DNA高度浓缩。在压缩了的单倍体精子核前端带着一个帽状的顶体囊或顶体（acrosomal vesicle or acrosome）。顶体是由高尔基体衍生而来的，内含分解蛋白质及多糖复合体的酶；因此，可以认为是一个被修饰了的分泌囊。储存在顶体内的酶被用于分解卵子外面的覆盖物。在海胆等许多动物中，在顶体囊和核之间有一个肌球蛋白分子区域。这些蛋白质分子在受精早期被用于从精子上伸出指状的顶体突起（acrosomal process）。在海胆和其它一些物种中，精子和卵子的识别涉及到顶体突起上的分子。顶体

4、和核共同构成精子的头部。精子运动的方式根据物种对环境的不同适应而存在差异。在有些物种中，如寄生性扁虫，精子通过细胞质膜伸出伪足行阿米巴运动。但大多数动物的精子能通过其尾部鞭毛（flagellum）的摆动而进行较长距离的运动。鞭毛是复杂的结构。鞭毛的主要驱动部分称为轴纤丝（axoneme）。它是由精子核基部的中心粒上发出的微管组成（Fig.7.3）。轴纤丝的核心是由两个中心微管和围绕在周围的组二联体微管组成。每组二联体微管中实际上只有一个微管是完整的，有13组蛋白质纤丝（Fig. 7.3B）。完整的微管三维空间模式见图7.3C。我们可以见到13个相互连接的蛋白质纤丝。蛋白质纤丝只由微管二聚体蛋白

5、构建。虽然微管蛋白是鞭毛结构的基础，其它一些蛋白质也对鞭毛功能起关键作用。推动精子的力量是由一种附着在微管上的力蛋白（dynein）提供的（Fig.7.3B）。力蛋白水解ATP分子,并将释放的化学能转换成推动精子机械能。这种能量允许二联微管外则的微管滑动，引起鞭毛歪曲。力蛋白的重要性可以在患有遗传性Kartagener triad症的个体上看到。这些个体的纤毛和鞭毛细胞中缺少力蛋白，表现为不能运动。患有这种疾病的雄性个体是不育的（精子不能运动），易患支气管炎（呼吸纤毛细胞不能运动），并有50%的可能性其心脏在右边。另一种重要的鞭毛蛋白似乎是组蛋白H1。这种蛋白质通常存在于细胞核中，将染色质折迭

6、成紧密的团粒。但Mutiger和同事发现组蛋白H1也能稳定鞭毛的微管使其不会解聚。“9 + 2”型微管伴随着力蛋白臂的排列已经在整个真核生物世界的轴纤丝中保存下来，说明这种排列非常适合于运动的能量转换。使鞭毛摆动和推动精子前进的ATP酶来自于精子中部的线粒体环。在许多物种（尤其是哺乳动物）中，有一层致密的纤维插在线粒体鞘和轴纤丝之间。这一纤维层增加了精子尾部的强度。由于这一纤维层向精子尾端逐渐变薄，因此这些纤维可能防止精子头部过分突然的摆动。因此，为了使头部能向卵子运动，精子经历了广泛的修饰。第一节 精子与卵子的识别（Recognition of egg and sperm）精子与卵子相互反应

7、的基本过程包括5个步骤（Figure7.8）：1、 卵子通过分泌的可溶性趋化分子吸引精子；2、 精子的顶体通过胞吐作用释放顶体内的酶；3、 精子结合到卵子的外膜上，即卵黄膜或透明带上；4、 精子穿过卵子的外膜；5、 卵子和精子质膜的融合。有时，第二步和第三步是反过来进行的（如哺乳动物的受精过程），精子在释放顶体内含物之前先结合到卵子的外膜上。在完成了这5步之后，单倍体的精子核和卵子核才可以相遇，启动发育过程的反应才会开始。在许多物种中，精子和卵子相遇不是一个简单的事件。许多海洋生物将它们的配子释放到环境中。这个环境可以小到是潮汐所产生的一个水洼，也可以大到是一个大洋。而且，在同一个时期其它的动

8、物也在释放出它们的精子和卵子。这些动物面对两个问题：（1）在配子被如此稀释后的浓度下，精子和卵子如何才能相遇；（2）如何阻止精子与其它物种的卵子受精。为解决这两个问题动物进化出了两种主要的机制：（1）物种特异性精子吸引（species-specific attraction of sperm）；（2）物种特异性精子活化（species-specific sperm activation）。精子吸引：远距离作用（Sperm attraction: action at a distance）已经证明在许多动物中都存在物种特异性精子吸引。在许多物种中，精子因趋化性（chemotaxis）而被吸向同种

9、卵子，即精子跟随卵子所分泌的某种化学物质的浓度梯度而向卵子运动。Miller将一种腔肠动物cnidarian不同发育阶段的的卵母细胞放在显微镜下有海水的载玻片上，再将精子放在有一定距离的地方。结果发现，未完成减数第二次分裂的卵母细胞不能吸引精子，而当完成了第二次减数分裂，卵子已准备好受精时，则精子会向卵子运动。因此，卵子不仅可以控制所吸引精子的类型，而且也控制吸引精子的时间，只有在需要受精时才吸引精子。趋化性的机制因物种不同而有差异。已经从海胆Arbacia punctulata的胶膜（egg ielly）中分离出来了一种趋化性分子，这是一种的含14个氨基酸的精子激活肽Resact。Resac

10、t在海水中很容易扩散，在非常低的浓度下都能对精子产生明显的作用（Figuer7.9）。当一滴含有海胆精子的海水放在载玻片上，可见到精子缓慢地作直径为50m的圆周运动。在隔一定距离处加入了少量的Rsact之后几秒钟内，精子迁移和聚集在加入了Rsact的区域。随着Rsact从加入处向外扩散，越来越多的精子添加进来而使聚集的精子团不断增大。Rsact只特异性吸引Arbacia punctulata的精子，而不能吸引其它物种海胆的精子。在Arbacia punctulata精子的质膜上有结合Rsact的受体，这是一种跨膜蛋白。当Rsact与受体的胞外部分结合时，位于胞内的鸟苷酸环化酶被活化，从而使cG

11、MP的浓度上升，进一步导致动力蛋白中的ATPase活化和激活线粒体的ATP生产装置，刺激精子的尾部摆动，使精子向Rsact浓度高的方向运动，直至到达卵子为止。海胆的顶体反应（The acrosome reaction in sea urchins）精卵之间的第二个相互反应是顶体反应。在大多数海洋无脊椎动物中，顶体反应包括两项内容：顶体泡与精子质膜的融合（胞吐作用导致顶体泡内含物的释放）以及顶体突起的伸出。海胆的顶体反应是精子与卵子胶膜接触而启动的。这种接触引起精子顶体泡的胞吐作用而使蛋白水解酶释放，蛋白水解酶在胶膜上产生出一个通向卵子表面的信道。其过程见图7.10。在海胆中，顶体反应的启动是精

12、子质膜与卵子胶膜中的至少三种成分相互作用的结果。这些成分直接结合到定位于精子质膜顶体处的特异性受体上。这种结合开启了精子细胞质膜上的钙离子通道，允许环境中的钙离子进入精子的头部。钙离子介导顶体膜与靠近的精子细胞膜融合而引起顶体泡的胞吐作用。启动顶体反应的海胆胶膜因子通常有高度的物种特异性。一种海胆胶膜中的碳水化合物不能激活即使是亲源关系很近的另一种海胆精子的顶体反应。如此，顶体反应的激活构建起了种间受精的一种壁垒。顶体反应的第二方面内容是顶体突起的伸出（Figuer7.10）。这种突起是通过球状肌动蛋白分子聚合成肌动蛋白纤维而伸出的。钙离子的流入被认为能激活定位于海胆精子的顶体区域和尾部的中段

13、的RhoB蛋白。这种GTP结合蛋白可以在许多细胞中帮助装配肌动蛋白细胞骨架，并被认为能激活肌动蛋白的聚合而制造顶体突起。海胆受精的物种特异性识别一旦海胆的精子穿过了卵子的胶膜，精子的顶体突起与卵子表面接触，精子和卵子之间就会发生另一种更严格的物种特异性识别（Figure7.14A）。调节这种识别的海胆顶体蛋白称为结合素（bindin）。从S. purpuratus顶体中分离到的结合素是一种不溶性蛋白，分子量为30,500 Da，能够与去掉了胶膜的同种海胆结合（Figure7.14B）。而且与卵子的相互反应是物种特异性的：从S. purpuratus顶体中分离来的bindin结合到同种的去膜卵上

14、，而不能结合到A. punctulata的去膜卵上。Moy和Vacquier用免疫技术证明bindin特异性定位于顶体突上，正好在精卵识别的位置处（Figure7.15）。生物化学的方法证明了亲源关系很近的不同种海胆的结合素的确存在差异。这一发现提示在海胆卵子的卵黄膜或质膜上存在物种特异性的bindin受体。这一点也在Vacquire和Payne用精子饱和海胆卵子的实验中得到了提示（Figure7-16A）。如图7-16A中所示，精子的结合并不发生在整个卵子表面。即使是在精子数量饱和状态下（约1500个精子），在卵的表面仍然有可容纳更多精子头部的空间，这就提示卵子的表面只有有限的精子结合位点。

15、从海胆卵子上分离到了一个分子量为350-kDa的糖蛋白分子，具有一些结合素受体的特性。结合素受体被认为能在卵细胞表面聚集成复合体，可能需要数百个这种复合体才能将精子束缚在卵子上（Figure7-16B）。综上所述，海胆中物种特异性配子识别是在精子吸引、精子活化和精子附着在卵子表面这样3个水平进行的。哺乳动物配子的结合和识别（Gamete binding and recognition in mammals）哺乳动物的受精是在输卵管中进行的。哺乳动物的精子与无脊椎动物和非哺乳类的脊椎动物精子不同。后两类动物的精子在离开精巢时即具有了使卵子受精的能力。而哺乳动物的精子必须经过在附睾中的成熟和在雌性

16、生殖道中获能，才具有使卵子受精的能力。精子在雌性生殖道内获得受精能力的现象称为精子获能。精子获能的过程可能分为两步。第一步去掉一些附着在精子表面的蛋白质。第二步是使精子质膜表面的糖蛋白发生改变，从而为顶体反应做好准备。精子获能可能与蛋白激酶A（PKA）等以及雌性生殖道内的受精促进肽等有关。已经获能的精子用精液处理又可去获能，失去受精能力。1、小鼠透明带上的精子结合蛋白ZP3（ZP3: The sperm-binding protein of the mouse zona pellucida）哺乳动物的透明带起与无脊椎动物的卵黄膜相似的作用。ZP3是生长期的卵母细胞合成和分泌的一种糖蛋白基质，在

17、受精过程中的两种主要作用是：与精子结合和在结合后启动精子的顶体反应。精子与卵子透明带的结合只有相对的，但不是绝对的物种特异性。因为在体内受精时配子的物种特异性识别不是一个主要的问题。小鼠的透明带由三种主要的糖蛋白组成。这些糖蛋白是ZP1、ZP2和ZP3。有一些证据证明ZP3（zona protein 3）是启动精子结合的糖蛋白。预先将小鼠的精子与溶解的透明带糖蛋白一起温育后，精子与卵子透明带的结合可以被抑制。用这种抑制实验，Bleil和wassarman发现ZP3是精子结合的活跃竞争物（Figure7-17）。也就是说，这种实验表明纯化了的ZP3（而不是ZP1和ZP2）可以和精子结合而阻止精子

18、与透明带的结合。放射性标记的ZP3（而不是ZP1和ZP2）结合在小鼠精子头部未受损的顶体上，这一实验结果也支持了这个结论。覆盖在精子头部的细胞膜上可以结合数千透明带上的ZP3糖蛋白。而且精子上似乎有数种不同的蛋白可以和ZP3结合（Figure7-18A）。许多这种精子蛋白是与ZP3上丝氨酸和苏氨酸连接的碳水化合物链相结合，提示ZP3的碳水化合物部分（moiety）对精子附着于透明带是关键的。这一结论得到了如下发现的支持：如果将ZP3上的碳链部分去掉，就不能与精子结合（Figure7-17B）。2、ZP3诱导的哺乳动物顶体反应（Induction of the mammalian acrosom

19、e reaction by ZP3）ZP3是小鼠透明带上与精子结合的特异性糖蛋白。ZP3也能在精子结合后启动精子的顶体反应。与海胆的卵黄膜不同，小鼠的透明带的结构较厚。通过在透明带上进行顶体反应，小鼠精子能够直接在附着处集中蛋白水解酶并通过消化作用在这一细胞外膜上形成一个通道（Figure7-8B）。的确，小鼠精子如在到达透明带之前发生了顶体反应，就不能穿过透明带。当ZP3与精子细胞膜上的受体交联后就会诱导顶体反应。交联的精子蛋白之一是半乳糖苷转移酶-I（galactosyltransferase-I），这是一种膜内酶，其活性部位朝外并结合在ZP3的碳水化合物残基上。这种交联激活精子细胞膜上的

20、特异性G蛋白，启动一个开启细胞膜上钙离子信道和引起钙离子介导的顶体泡胞吐作用的联级反应。钙离子能激活细胞骨架融合蛋白（the SNARE complex）。这种细胞骨架融合蛋白与脾脏细胞（释放消化酶）、神经元（释放神经替质）及肥大细胞（释放组胺）等胞吐作用时激活的细胞骨架融合蛋白看来是相同的。3、穿过透明带（travering the zona pellucida）顶体泡的胞吐作用释放多种分解透明带的蛋白酶。这些酶产生一个使精子能到达卵子的通道。然而在顶体反应过程中，精子前端的细胞膜，即含有ZP3结合位点的区域，会从精子上脱落下来（Figure7-11）。但如果精子要穿透透明带，则必须要用某种

21、方式保持与透明带的某种结合。在小鼠中，这种与透明带的第二次结合是由顶体内膜上一些能与ZP2糖蛋白特异性结合的蛋白质来完成。因此顶体完整的精子不能与ZP2结合，而发生了顶体反应的则可以。此外，ZP2糖蛋白的抗体不能阻止顶体完整的精子与透明带结合，但能抑制顶体反应后的精子附着于透明带。透明带的结构由ZP3和ZP2的重复单位组成，有时通过ZP1交联（Figure7-17A）。显然顶体反应后的精子能将与透明带的结合从ZP3转移到ZP2上。第二节 配子融合与阻止多精受精（Gamete fusion and the prevention of polyspermy）卵子和精子细胞膜融合（fusion of

22、 the egg and sperm cell membranes）一旦精子完成了顶体反应并与卵子接触，精子与卵子细胞膜的融合就开始了。海胆精子进入卵子的过程图解于图7-19。精卵融合似乎引起卵子中肌动蛋白的聚合而形成受精锥（fertilization cone）。卵子和精子之间的同源性再一次得到证明，因为顶体突起也是通过肌动蛋白的聚合而形成的。来自配子的肌动蛋白形成的连接扩大卵子和精子之间的细胞质桥，精子核和尾通过这个桥。哺乳动物配子的融合也经历类似的过程（Figure7-20）。在海胆中，卵子细胞膜的所有区域都可以和精子融合。在其它一些物种中，质膜的一定区域被特化为精子识别和融合的区域。融

23、合是一个主动的过程，通常由特异的“融合”（fusogenic）蛋白介导。已经有证据表明海胆精子的bindin所起的第二个作用就是作为融合蛋白。除了识别卵子之外，结合素在其N-末端有一个伸展的长疏水氨基酸片段，这个区域可以在体外使磷脂泡融合。在哺乳类中，精子与卵子的接触不是在精子的顶端，而是在精子头部的侧面，被称为精子头部赤道区的地方（Figure7-20）。有关哺乳动物精子和卵子融合的机制目前仍存在争论。基因敲除实验表明哺乳动物配子的融合可能依赖于精子蛋白与卵子（与整合相关）CD9蛋白的相互作用。CD9基因被敲除的雌性小鼠由于所产的卵子不能与精子融合而是不育的。这种不育性可以通过显微注射编码小

24、鼠或人CD9蛋白的mRNA而被逆转。目前仍不知道这种蛋白促进细胞膜融合的确切机制。但已知CD9对成肌细胞（肌肉细胞的前体）形成骨骼肌的多核肌管是至关重要的。防止多精受精（The prevention of polyspermy）一个精子进入了卵子后，带入了一个单倍体的细胞核和一个中心粒。正常单精受精只有一个精子进入卵子，单倍体的精子核和卵子核合并而形成受精卵的二倍体合子（zygote）核，恢复这个物种的二倍体染色体数目。精子带入的中心粒在卵裂时分裂形成有丝分裂纺锤体的两极。多精受精，即多个精子进入卵子，在大多数动物中会造成灾难性的后果。在海胆中，双精受精产生三倍体细胞核。每一号染色体不是两条而

25、是有三条同源染色体。由于每个精子的中心粒都复制、分裂而形成有丝分裂器的两极，因此，双精受精形成的有丝分裂纺锤体不是形成两极，而可能形成四极；染色体不能均匀等地分到两个子细胞中，而可能分到多达4个细胞中。由于没有一种机制能保障这4个细胞能得到正确数目和组型的染色体，染色体会不均等地分离。有的细胞得到了多余的染色体，另一些细胞则缺少了染色体。这些细胞或者死亡或者畸形发育（Figure7-21）。各个物种都已经进化出了一些防止两个以上单倍体核合并的方法。最常用的发就是防止一个以上的精子进入卵子。海胆有两种机制避免多精受精：（1）通过卵子细胞膜上膜电位的变化完成的快速反应机制和（2）由皮层颗粒胞吐作用

26、引起的慢速反应机制。快速阻止多精受精（The fast block of polyspermy）快速阻止多精受精是通过卵子质膜上的电位变化实现的。这种电位发生变化了的细胞膜提供了细胞质与外界环境之间的选择壁垒，使卵子内的离子浓度与环境中的离子浓度有很大差异。特别是钠和钾离子浓度的差异更明显。海水中钠离子的浓度特别高，而卵子细胞质中的浓度相对很低，但钾离子的情况则正好相反。这种差异是由于细胞膜总是抑制钠离子进入卵母细胞和阻止钾离子扩散出去而维持的。如果我们在卵子中插入一个电极，在卵子外安置另一个电极，我们就可以测量卵子细胞膜内外的电荷的差异。这种细胞膜上的静止电位差一般是70mv，通常用-70m

27、v来表示；因为在细胞内相对于细胞外是带负电的。在第一个精子结合到卵子质膜后的1-3秒之内，膜电位转变为带正电荷，约为+20mv。这种转变是由于少量的钠离子流入卵子中造成的（Figure7-22A）。虽然精子能与静止电位为-70mv的卵子质膜融合，但不能与静止电位为正的细胞膜融合，因而不会有更多精子与卵子融合。但尚不清楚钠离子流入卵子的增加究竟是第一个精子与卵子质膜的结合所引起的，还是第一个精子与卵子质膜的融合所引起的。钠离子和静止电位变化的重要性已经得到了证明。Laurinda Jaffe等发现，如果海胆卵被放在人工电场中使其保持膜电位的负电性，则海胆卵子会发生多精受精。相反，如果保持膜电位的

28、正电性则可以完全抑制受精。通过降低水环境中钠离子的浓度也可以避免快速阻止多精受精（Figure7-22 B-D）。如果钠离子的供应不足以有效引发膜电位的转换，就会发生多精受精。尚不清楚精子细胞膜对膜电位的变化如何反应以阻止第二个精子的进入。最可能的方式是精子带有对电压敏感的成分，这种成分插入到卵子细胞膜可能受跨膜电流变化的调节。电阻止多精受精的机制在蛙类中也存在，但在大多数哺乳动物中可能不存在。慢速阻止多精受精机制（The slow block to polyspermy）海胆和大多数其它动物有第二种防止多精受精的机制，即慢速阻止多精受精机制，以保障多余的精子不会进入卵子细胞质。快速机制是一种

29、暂时的机制，因为海胆卵子质膜维持正电性只有大约1分钟。这种短暂的电位转换不足以防止多精受精，如果附着在卵黄膜上的精子不能以某种方式去掉，则多精受精仍能发生。卵子是通过皮层反应（cortical granule reaction）来去掉多余精子的。这种较慢的化学防止多精受精的机制在第一个精子与卵子融合后约一分钟被激活。紧靠在海胆卵子质膜之下有大约15,000个皮层颗粒。每个颗粒的直径约为1m（Figure7-6B）。在精子进入后，这些皮层颗粒与卵子质膜融合，将其内含物释放到卵子质膜与卵黄膜之间的空隙中。这种皮层颗粒的胞吐作用释放出几种蛋白质。第一种蛋白质是一种胰酶样蛋白酶，称为皮层颗粒丝氨酸蛋白

30、酶（cortical granule serine protease）。这种酶分解连接卵黄膜蛋白与质膜之间的连接蛋白，并将结合素（bindin）受体与结合在其上的精子分离。皮层颗粒释放的第二种蛋白是粘多糖（mucopolysaccharides），粘多糖有很强的吸水能力，释放后形成一种渗透梯度，通过它的吸水而使水分进入到卵黄膜与质膜之间的空隙中，导致卵膜膨胀而变成为受精膜（fertilization envelope，Figuger7-23，7-24）。皮层颗粒释放的第三种蛋白是过氧化物酶（peroxidase），其作用是通过将相邻蛋白质的酪氨酸残基交联而使受精膜变硬，防止变性而能有效地保护胚

31、胎的发育。如图7-23所示，受精膜在精子入卵处开始形成，再扩展到整个卵子。受精膜一旦形成，附着的精子便从膜上释放。这一过程在精子附着后约20秒时开始，在受精后约1分钟时结束。皮层颗粒释放的第四种蛋白成分是透明素（hyalin）。透明素只含酸性氨基酸，不含碱性氨基酸。透明素聚集在受精卵质膜的表面连成一层，在有钙离子存在的条件下是一种粘性很强的胶状物。卵子伸出的微绒毛的顶端附着在这层胶状物上，使受精卵在随后分裂时形成的卵裂球能保持在一起而不会分离。在哺乳动物中，皮层反应不会产生受精膜，但其最终的效应是相同的。释放的酶修饰透明带上的精子受体而使其不能再与精子结合。已经发现小鼠的皮层颗粒含有N-乙酰氨

32、基葡糖苷酶（N-acetylglucosaminidase）。这种酶能从ZP3碳水化合链上将N-乙酰氨基葡糖苷解离下来。N-乙酰氨基葡糖苷是与精子结合的碳水基团之一。Miller等在1992年证明，当N-乙酰氨基葡糖苷残基在受精时被解离后，ZP3就不能再作为底物与其它的精子结合。ZP2被另一种皮层颗粒分泌的蛋白酶所分解。然后也失去了与精子结合的能力。所以，一旦有一个精子进入了卵子，其它的精子就不再能与透明带结合和维持这种结合，并迅速从透明带离开。钙离子启动皮层颗粒反应皮层颗粒反应的机制与顶体反应的机制相似，并可能涉及同样的分子。一旦受精，卵子内游离钙离子的浓度大大增加。在这种高钙离子的环境里，

33、皮层颗粒膜与细胞质膜融合，释放其内含物。一旦皮层颗粒的融合在精子入卵处开始，皮层颗粒胞吐作用的波就会围绕皮层向卵子的另一面迅速传布。在海胆和哺乳动物中，与皮层反应相关的钙离子浓度升高不是由于细胞外钙离子的流入的结果，而是卵子细胞内储存钙离子的释放的结果。这种钙离子的释放可以用钙离子激活的水母发光蛋白（aequorin）等发光染料或furo-2等荧光染料进行监测。这些染料在结合了游离的钙离子后能发出光来。当海胆被注入了染料后进行受精，可看到钙离子释放的冲击波从精子入卵点开始在卵子上的传布（Figure7-25）。海胆中钙离子的释放的整个过程大约为30秒，随后游离的钙离子又重新被隔离。几组实验证明

34、钙离子直接与皮层颗粒反应的传布相关，并且这些钙离子是储存在卵子中的钙离子。A23187是一种钙离子载体（ionophore），能使游离钙离子穿越细胞膜和向其他地方运输。将未受精的海胆卵子放在含有A23187的海水中，可以引起皮层反应和受精膜的举起。而且，这些反应可以在完全没有钙离子的水中发生。因此A23187一定是引起了储存在卵子细胞器中的钙离子的释放。皮层颗粒本身与卵子质膜通过一系列整合蛋白进行连接，这些蛋白质有利于钙离子介导的胞吐作用。在海胆和脊椎动物中，与皮层颗粒反应相关的钙离子是储存在卵子的内质网中（但螺蛳和线虫不是）。海胆和蛙的内质网在皮层中很明显，围绕在皮层颗粒周围（Figure7

35、-26）。非洲爪蟾的皮层内质网的丰富程度在卵子成熟时增加10倍，而在皮层颗粒胞吐作用发生后1分钟消失。一旦启动，钙离子的释放就是自动扩散的。游离的钙离子能使被束缚钙离子从储存的地方释放出来。游离钙离子产生的机制：在精子接触点上，磷脂酰肌醇（PI）信号传导通路被启动。几秒之内产生第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二乙酰甘油（DAG），以及环鸟苷酸（cGMP）和环腺苷二磷酸-核糖（cAMP-ribose）。第二信使和环腺苷二磷酸-核糖，可能还有精子提供的激活因子，导致一些二价钙离子从此处内质网中释放到细胞浆中，游离钙离子进一步引起邻近内质网中钙离子的释放，从而形成钙波传布至整个卵子。这种正向的反馈回路

36、导致受精卵中游离钙离子猛增。游离的钙离子很快又被泵回到内质网中被固定起来。由于游离钙离子引起皮层颗粒胞吐作用，如此，钙离子释放波导致皮层颗粒胞吐波。第三节 卵子代谢的激活（The activation of egg metabolism）受精除了使两个单倍体核整合之外，另一个同样重要的作用是启动发育过程。这一事件发生在细胞质中，与细胞核无关。成熟的海胆卵子是一个代谢处于睡眠状态的细胞，受精能使其代谢被激活。这种激活是一种刺激。卵子对精子的应答可以划分为“早期”应答和“晚期”应答两个阶段。早期应答发生在皮层反应的几秒钟之内，晚期应答发生在受精后数分钟之内。早期应答（early responses

37、）如前面我们已经看到的，海胆精子与卵子的接触和融合激活防止多精受精的两种主要机制：因钠离子进入细胞质而启动的快速阻止机制；因细胞内钙离子释放而启动的慢速阻止机制。所有卵子的激活似乎都依赖于卵子内游离钙离子浓度的升高。与皮层颗粒反应相关的钙离子释放也与卵子重新进入细胞周期和重新激活蛋白质合成有关。在哺乳类中有数个钙离子波在卵子中传递。Ducibella等最近的研究标明，不同的卵子激活活动由不同数量的钙离子波启动；而且，一个钙离子波启动的事件如果没有另外的钙离子波就可能不能完成。二价的钙离子对启动胚胎的发育是必须的。如果将钙离子螯合剂EGTA注射到海胆卵子中，受精后就不会发生皮层颗粒反应，不会有膜

38、静止电位的变换，也不会重新启动卵子的分裂。相反，卵母细胞在没有精子参与的情况下可以通过人工处理使钙离子释放而激活。Steinhardit等发现注射很少量的钙离子载体A23187到海胆卵子中，诱导了大部分与正常受精特征相同的应答反应。如受精膜举起，细胞内pH值升高，耗氧率的突然增加，蛋白质和DNA合成增加等都按照正常的秩序出现了。卵子在第一次卵裂之前，这些现象在大多数都处在停止状态，因为卵子仍然是单倍体，也缺少分裂所需要的精子中心粒。钙离子的释放激活了一系列代谢反应（Figure7-27）。其中的一个反应就是激活NAD+激酶，此酶将NAD+转换成NADP+。这种转换会对脂肪代谢产生重要的影响。因

39、为NADP+（而不是NAD+）可以作为脂肪生物合成的辅酶。因此，NAD+转换成NADP+对卵裂过程中所需要的大量新细胞膜的构建有重要的作用。钙离子的释放也影响氧的消耗，在受精过程中可见到一个耗氧的高峰，耗氧量的大部分被用于交联受精膜。与这种氧耗相关的酶也是NADPH依赖型的。晚期应答受精的晚期应答包括DNA合成和蛋白质合成。海胆精子与卵子的融合引起细胞内pH值升高。这种细胞内pH值的升高开始于第二次钠离子向细胞内流入，导致海水中的钠离子与卵子中的H+离子按1 ：1的比例进行交换。H+的流出导致卵子中pH的升高。钙离子浓度和pH值的升高共同作用刺激新的蛋白质和DNA合成。如果用实验使未受精卵中的

40、pH值提高到与受精卵中一样高，则也会和受精卵中一样进行DNA的合成。钙离子对DNA合成也同样重要。Ca2+使MAP激酶失活，将其从活化的磷酸化状态转换成非活性的去磷酸化状态。MAP激酶的失活去掉了DNA合成的一个抑制因子。因此，游离钙离子波使MAP激酶失活后，DNA合成得以恢复。在海胆中，蛋白质的合成一般在精子入卵后数分钟出现高峰。用转录抑制剂actimomacin D注射到受精卵中，证明这种蛋白质的合成不依赖于新mRNA的合成，而是利用已经储存在卵母细胞质中mRNA（Figure7-30，Table5-2）。这些mRNA编码组蛋白，微管蛋白，肌动蛋白以及早期发育过程中需要的一些形态发生因子。

41、这种蛋白质合成高峰可以用氨离子人工提高细胞质中的pH而诱导出来。储存mRNA翻译活性的全面提高的机制似乎是mRNA的抑制因子被解除。在海胆卵母细胞中有一种抑制因子结合在翻译启动因子eIF4E上，能阻止翻译的发生。但在受精后，这种4E结合蛋白被磷酸化并被降解，从而允许储存的mRNA进行翻译。有人认为受精时被激活的一种激酶与4E结合蛋白的磷酸化有关。卵子激活机制的两种假说：（1）受体假说：精子与卵子表面特异性受体结合，活化磷脂酶C（PLC）。PLC作用于PIP2（4,5-磷酸酰肌醇二磷酸），使其水解为IP3（1,4,5-三磷酸肌醇）和DAG（乙酰甘油）。IP3与钙储存位点结合，促使钙离子从内质网中

42、释放。DAG则激活蛋白激酶C（PKC），加速钠的流入和H+的流出，使受精卵内的pH上升。从而诱导卵的激活。（2）融合假说：精卵质膜融合后，精子的一种可溶性因子进入卵子而使卵子激活。显微注射精子提取物到未受精卵子内，能激发钙离子浓度上升、皮层反应、原核形成和卵裂。精子提取物无种的特异性。直接把精子注入卵内，亦可诱发卵的激活。但精子因子尚未被提纯出来。第四节，遗传物质的融合（Fusion of the genetic material）海胆遗传物质的融合在海胆中，精子核垂直穿过卵子表面进入卵子中。在精子和卵子细胞膜融合后，精子核以及中心粒与线粒体及鞭毛分离。线粒体和鞭毛没有进入卵子中，因此，几乎没

43、有精子来源的线粒体存在于发育中的胚胎和成体中。所以，虽然每个配子都为合子提供了一个单倍体基因组，线粒体基因组主要是母本遗传来的。相反，几乎所有已经研究过的动物中，形成有丝分裂器纺锤体所需要的中心体则来自于精子的中心粒。只有小鼠是例外。在海胆中，受精发生在第二次减数分裂之后。因此，在精子进入时卵子细胞质中存在一个雌性原核（female pronucleus）。进入卵子后，精子核在去致密形成雄性原核（male pronucleus）的过程中经历一系列戏剧性的变化。首先，精子核膜泡状化，使浓缩的染色质直接与卵子细胞质接触。这种变化使精子的染色质能去致密。海胆精子核的去致密似乎是从核膜的lamin蛋白

44、质磷酸化，以及精子中特有的、紧密结合在DNA上的两种组蛋白的磷酸化开始的。当精子与卵子胶膜中的一种糖蛋白接触时，这个磷酸化过程就开始了。这种蛋白质可提高一些依赖于c-AMP的蛋白激酶的活性。这些蛋白激酶使精子特有的组蛋白的一些碱性氨基酸残基磷酸化，改变这些组蛋白与DNA的结合能力。精子核染色体的去致密有利于精子特有的组蛋白被储存在卵母细胞质中的正常染色体组蛋白所替代。去致密后，DNA就能开始转录和复制。然后核膜又在去致密的染色体周围重新出现而形成雄性原核。海胆精子进入卵子细胞质后，雄性原核转动180o，这样精子中心粒便处在了雄原核和雌原核之间。然后，精子中心粒作为微管组织中心伸出自己的微管并整

45、合卵子的微管形成一个星状体（aster）。这些微管伸展在整个卵子中并与雌原核接触，使雌、雄原核相互靠近。雌雄原核的融合形成二倍体的合子核（zygote nucleus，Figure7-31）。海胆雌雄原核的形成和迁移过程在1小时以内。DNA合成的开始可以是在原核阶段（迁移过程中），也可以是在合子核形成以后；并依赖于在受精早期钙离子的释放。哺乳动物中遗传物质的融合（Fusion of genetic material in mammals）哺乳动物中原核迁移的过程需要大约12小时。哺乳类精子进入卵子不是垂直地穿过卵子的表面，而几乎是与卵子表面成切线方向进入的，并与卵子伸出的许多微绒毛进行融合（F

46、igure7-20）。精子的DNA与称为鱼精蛋白的碱性蛋白质结合，鱼精蛋白通过二硫键使染色体紧密折叠。卵子细胞质中的谷光苷肽分解这种二硫键，使精子染色质去致密。哺乳动物精子入卵时，卵母细胞的核正被抑制在第二次减数分裂的中期（Figure7-32A，7-5）。钙离子的振动使MAP激酶失活而使DNA能够合成。但与海胆卵子已经处于单倍体状态不同，哺乳动物卵母细胞在减数分裂中期仍是二倍性的。钙离子振动激活另一种激酶导致周期蛋白和securin蛋白（一种使中期染色体保持在一起的蛋白质）被分解而使细胞周期继续进行。DNA的合成在雌雄原核中分别进行。中心体伴随着雄性原核产生星状体，其微管连接到两个原核上并使

47、其相互靠近。一旦相遇，两个原核的核膜就破裂（Figure7-23B）。但不象海胆中那样形成一个共同的合子核，雌雄原核的染色质分别浓缩形成染色体再排列在共同的有丝分裂纺锤体赤道板上（Figure7-32C）。因此，哺乳动物真正的二倍体细胞核不是在合子期出现的，而是在两细胞期才出现的。精子的线粒体以及线粒体的DNA在卵子细胞质中被降解。所以个体的所有线粒体都来自于母亲。第五节 卵子细胞质的重排（Rearrangement of the egg cytoplasm）受精能启动卵子细胞质物质的重新排列。在哺乳类和海胆中这种细胞质的运动不是很明显，但在一些物种中这种卵母细胞质的重排对以后发育的细胞分化有

48、非常重要的意义。在被囊动物的卵子中，由于卵子的不同区域有不同的色素而使卵母细胞质的重排特别明显。这种细胞质的运动在两栖类的卵子中也很容易观察到。在蛙类中，一个精子可以在卵子动物半球的任何位置进入卵子。当精子进入后，可以改变卵子细胞质的分布式样。精子未进入时，卵子是以卵轴为中心辐射对称的。精子进入后，皮层细胞质朝着精子入卵点转动约30o，但卵子的内细胞质没有转动。在豹蛙等的卵子动物半球的一个区域被颜色较深的皮层细胞质所覆盖，当皮层细胞质转动后就被显示出来（Figure7-33）。这个皮层下的细胞质区域靠近卵子赤道处，正好在精子入卵点的对面。因含有一些可扩散的色素颗粒而呈灰色。故这个区域特称为灰色

49、新月区（gray crescent）。非洲爪蟾卵子上看不到灰色新月区。但用染料标记也证明了皮层细胞质相对于皮层下的细胞质转动约30o。两栖类细胞质运动的动力可能来自于一列平行排列的微管。这列微管位于植物半球的皮层和内细胞质之间，其排列方向与细胞质转动的方向平行。这些微管细丝最初在细胞质转动前出现，在转动停止后便消失（Figure7-34）。在转动开始时用秋水仙素或紫外线处理卵子阻止这些微管的形成，便可以抑制卵子细胞质的转动。用能和微管结合的抗体，Houliston等证明构成这些细丝的微管既来自于精子也来自于卵子，精子的中心粒指导微管的聚合并向植物半球区域生长。到达植物半球区域皮质后，微管朝离开精子入卵点的方向弯曲，伸向植物极。到第一次卵裂周期的末期，细胞质已经重排，原核也已经相遇，DNA正在复制，新的蛋白质开始翻译。即进入了多细胞有机体发育阶段。