生物化学篇生物大分子的结构与功能蛋白质学习PPT教案.pptx

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1、本篇讨论生物大分子的结构与功能.蛋白质、核酸和酶重点掌握: 物质的结构特征, 重要功能, 理化性质及应用H2N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-COOH|R1|R2|R3|R4|RnO=O=O=O=HHHH蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第第 一一 章章Structure and Function of Protein一、什么是蛋白质?蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键通过肽键(peptide bond)相相连形成的高分子含氮化合物。连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1. 蛋白质是生物蛋

2、白质是生物 体重要组成成分体重要组成成分分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。有蛋白质。含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。1 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）2 2）代谢调节作用）代谢调节作用3 3）免疫保护作用）免疫保护作用4 4）物质的转运和存储）物质的转运和存储5 5）运动与支持作用）运动与支持作用6 6）参与细胞间信息传递）参与细

3、胞间信息传递2. 蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能3. 氧化供能氧化供能蛋 白 质 的 分 子 组 成The Molecular Component of Protein第 一 节 组成蛋白质的元素主要有主要有C、H、O、N和和S。 有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素或金属元素铁、铁、铜、锌、锰、钴、钼铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘 。 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以只要测定

4、生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 ( g % )= 每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16% 蛋白质元素组成的特点一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有有20种，且均属种，且均属 L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H1. 非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸2. 极性

5、中性氨基酸极性中性氨基酸3. 酸性氨基酸酸性氨基酸4. 碱性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类* * 20 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下: :甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.301. 非极性疏水性氨基酸非极

6、性疏水性氨基酸色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89 丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68 酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.602. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic a

7、cid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593. 酸性氨基酸酸性氨基酸4. 碱性氨基酸碱性氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-C

8、H-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3（二）氨基酸的理化性质1. 两性解离及等电点两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。于所处溶液的酸碱度。等电点等电点(isoelectric point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值值称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。pH=pI+OH-pHpI+H+O

9、H-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+2. 紫外吸收紫外吸收 色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在的最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大多数蛋白质含大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收3

10、. 茚三酮反应茚三酮反应 氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色蓝紫色化合物，其最大吸收峰在化合物，其最大吸收峰在570nm处。处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。二、肽* 肽键肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的是由一个氨基酸的 -羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的 -氨基脱水缩合氨基脱水缩合而形成的化学键。而形成的化学键。（一）肽(peptide)NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-

11、CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO* * 肽肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。合物。* * 两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨，三分子氨基酸缩合则形成基酸缩合则形成三肽三肽* * 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为不全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residue)。* * 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡寡肽肽(oligopepti

12、de)，由更多的氨基酸相连由更多的氨基酸相连形成的肽称形成的肽称多肽多肽(polypeptide)。N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽链有两端* 多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。酸之间以肽键连接而成的一种结构。N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶（二） 几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione, GSH)GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADP

13、H+H+ NADP+ 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2. 多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽三、蛋白质的分类 * * 根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质 = = 蛋白质部分蛋白质部分 + + 非蛋白质部分非蛋白质部分* * 根据蛋白质形状根据蛋白质形状 纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质蛋 白 质 的 分 子 结 构The Molecular Structure of Protein 第 二 节蛋白质的分子结构包括 一级结构一级结构(primary structure)二级结构二

14、级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级高级结构结构定义定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。顺序。一、蛋白质的一级结构主要的化学键主要的化学键肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。功能的基础。目录二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽

15、链主链骨架原子的相对空结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。定义定义 主要的化学键主要的化学键： 氢键氢键 （一）肽单元参与肽键的6个原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一平面，C 1和C 2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。 蛋白质二级结构的主要形式 - -螺旋螺旋 ( -helix ) - -折叠折叠 ( -pleated sheet ) - -转角转角 ( -turn ) 无规卷曲无规卷曲 ( random coil ) （二）

16、 - -螺旋目录（三） - -折叠（四） -转角和无规卷曲 - -转角转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。分肽链结构。 （五）模体在许多蛋白质分子中，可发现二个或在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体模体(motif)。钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子的模体合钙离子的模体 锌指结构锌指结构 （六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。蛋白质二级结构是以一级结构为

17、基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成 - -螺旋螺旋或或-折叠，它就会出现相应的二级结构。折叠，它就会出现相应的二级结构。 三、蛋白质的三级结构三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。力等。 主要的化学键主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一） 定义 目录 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) N 端端 C端端纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 （二）结构域大分子蛋白质

18、的三级结构常可分割成一个或大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域行使其功能，称为结构域(domain) 。（三）分子伴侣分子伴侣分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。* * 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。使肽链正确折叠。

19、* * 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。后，再诱导其正确折叠。 * * 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。形成起了重要的作用。 亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。是氢键和离子键。四、蛋白质的四级结构四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级蛋白质的四级结构结构。有些蛋白质分子含有二条

20、或多条多肽链，有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的质的亚基亚基 (subunit)。血红蛋白血红蛋白的四级结构的四级结构 蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第 三 节（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态

21、，无活性（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系 Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合， Hb与与O2结合后称为结合后称为氧合氧合Hb。氧。氧合合Hb占总占总Hb的百分数（称的百分数（称百分饱和度百分饱和度）随

22、）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线* 协同效应协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为合能力的现象，称为协同效应协同效应。 如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative

23、 cooperativity)O2血红素与氧结血红素与氧结合后，铁原子半径合后，铁原子半径变小，就能进入卟变小，就能进入卟啉环的小孔中，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。变构效应变构效应(allosteric effect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应变构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导象发生改变，仍可影响其功能，严重时可

24、导致疾病发生。致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的

25、一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第四节蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein（一）蛋白质的两性电离 一、理化性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基

26、可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至

27、万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用

28、下，其特定的在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。物活性的丧失。 造成变性的因素造成变性的因素如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。 应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌

29、。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为象和功能，称为复性复性(renaturation) 。 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性* * 蛋白质沉淀蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧

30、链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 （四）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质

31、定量测定。（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。三酮反应。 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。二、蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利

32、用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。开的方法。* * 超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *盐析盐析(salt precipitation)是

33、将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。 * * 免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。离获得抗原蛋白。 （三）电泳蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带

34、电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术质的技术, , 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。胶电泳等。 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的

35、电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技是蛋白质组学研究的重要技术。术。（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用

36、的层析方法* * 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。* * 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利利用用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。目录目录（五）超速离心* * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient, S

37、)表示表示,沉降系沉降系数与蛋白质的密度和形状相关数与蛋白质的密度和形状相关 。因为沉降系数因为沉降系数S大体上和分子量成正比大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。维状蛋白质不适用。三、多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺

38、序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列四、蛋白质空间结构测定* 二级结构测定二级结构测定通常采用通常采用圆二色光谱圆二色光

39、谱( (circular dichroism，CD) )测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 - -螺旋的螺旋的CDCD峰有峰有222nm222nm处的负峰、处的负峰、208nm208nm处的处的负峰和负峰和198 nm198 nm处的正峰三个成分；而处的正峰三个成分；而 - -折叠的折叠的CDCD谱不很固定。谱不很固定。 * 三级结构测定三级结构测定X射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共和核磁共振技术振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。研究蛋白质三维空

40、间结构最准确的方法。 * * 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。空间结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构* * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。用于新的蛋白质空间结构的预测。钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子的模体合钙离子的模体 锌指结构锌指结构 目录 天然状

41、态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合， Hb与与O2结合后称为结合后称为氧合氧合Hb。氧。氧合合Hb占总占总Hb的百分数（称的百分数（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正

42、常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。物活性的丧失。