《菌物学报》中文投稿-参考模板.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流菌物学报中文投稿-参考模板.精品文档.河北省马铃薯早疫病菌群体遗传结构的研究张福光 杨志辉 朱杰华* 张宏磊 魏巍河北农业大学植物保护学院 河北 保定 071000摘 要：通过对20092010年河北省145株及外省30株马铃薯早疫病菌对代森锰锌的敏感性、产孢量两个表型性状和AFLP基因型的测定，揭示了河北省早疫病菌群体的遗传结构。毒力测定表明所有供试菌株对代森锰锌均表现敏感，其EC50范围介于1.044.86g/mL之间，平均为2.93g/mL。被测河北省47株早疫病菌产孢量平均为85个孢子/mm2，大大高于30个对照菌株的产孢量，对照菌株

2、的平均产孢量为50个孢子/mm2，菌株间产孢量存在明显差异。AFLP聚类分析揭示出了马铃薯早疫病菌丰富的遗传多样性，每个菌株都具有独特的AFLP基因型。早疫病菌AFLP基因型与地理来源存在着密切的相关性，与菌株产孢量有一定的相关性，但与代森锰锌敏感性无相关性。关键词：茄链格孢，代森锰锌，产孢量，扩增片段长度多态性Population structure of Alternaria solani on potato in Hebei ProvinceZHANG Fu-Guang YANG Zhi-Hui ZHU Jie-Hua* ZHANG Hong-Lei WEI WeiCollege of

3、Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071000, ChinaAbstract: The population genetic structure of 145 isolates of Alternaria solani collected from potato in Hebei Province and 30 ones in other four provinces in China from 2009 to 2010 was revealed by phenotypes such as vi

4、rulence of Mancozeb and sporulation capacity in combination with AFLP genotype. The test of virulences showed that all tested isolates of A. solani were sensitive to Mancozeb, with EC50 values of 1.044.86g/mL, averaging 2.93g/mL. Average sporulation quantity of the tested 47 isolates in Hebei Provin

5、ce and 30 ones in other four provinces used as control were 85 and 50 conidia/mm2 repectively, showing significant difference. AFLP genotypes revealed a high diversity of A. solani collected from potato and each isolate had a specific AFLP genotype. AFLP genotype of isolates was closely related to t

6、he geographic origin, and related to a certain extent to sporulation quantity, but not correlated with sensitivity of mancozeb to pathogen.Key words: Alternaria solani, Mancozeb, sporulation quantity, AFLP近年来，马铃薯早疫病已逐渐成为河北省马铃薯主产区的一种为害严重的重要病害，给当地马铃薯生产造成了巨大损失。已引起现代马铃薯产业技术体系专家组、马铃薯病害专家、马铃薯生产单位以及管理部门的高度

7、重视，已将其列为“十二五”期间马铃薯病害上急需解决的重点生产难题。该病由茄链格孢Alternaria solani侵染引起（Ellis & Martin 1882）。该菌在我国分布亦十分广泛，几乎遍布各个省、市、自治区，可以引起多种植物病害（张天宇 2003）。以前由于茄链格孢引起的病害一般为害程度较轻，以至于对病原菌有关群体生物学特性方面的研究相对较少，为了更好和更有效地防控河北省日趋严重的马铃薯早疫病，对病原菌群体遗传学研究显得十分重要。病原菌群体结构与病害的发生密切相关，了解马铃薯早疫病菌产孢量、对药剂的敏感性及其基因型，可为深入分析马铃薯早疫病发生与流行规律提供依据（Rotem 199

8、4）。国外学者已将同工酶、RAPD、RFLP和AFLP等分子标记技术应用于马铃薯早疫病菌及相关种类的遗传多样性研究。Petrunak & Christ（1992）研究结果表明，同工酶技术不适于分析早疫病菌种内的遗传差异。Weir et al.（1998）的研究表明，RAPD标记可鉴别出不同寄主的早疫菌，但不能区分不同地理来源地菌株。Sharma & Tewari（1998）利用RAPD技术分析了寄生于十字花科的3种链格孢属真菌Alternaria brassicae，A. brassicicola和A. raphani，发现其基因型分化和地理来源密切相关。Adachi et al.（1996）

9、通过RFLP标记技术分析了A. alternata遗传多样性和其对杀菌剂抗性之间的关系，结果表明二者之间并没有明显关系。Martnez et al.（2004）利用AFLP技术分析了早疫病菌的遗传多样性，发现AFLP分子标记适用于早疫病菌的遗传多样性分析，病原菌具有丰富的多样性，其遗传多样性与地理来源和寄主有一定相关性。然而，我国对马铃薯早疫病的研究仍停留在初级阶段，主要集中在室内毒力测定和田间药效防治，此外还有一些与寄主抗病性有关的零星报道。梁伟伶等（2009）通过室内试验筛选出了抑制马铃薯早疫病的药剂，代森锰锌与嘧菌酯9:1混配时抑制效果最好，其EC50小于1g/mL；刘洋等（2006）研

10、究发现草酸、KCl、FeSO4均可诱导马铃薯块茎产生对早疫病的抗性；台莲梅等（2010）研究发现PAL、POD、PPO和CAT这4种防御酶与马铃薯对早疫病的抗病性有一定关系；张振粉等（2010）对番茄早疫病菌致病力进行了初步研究。然而，在我国有关马铃薯早疫病菌群体结构方面的研究未见报道。本研究拟通过测定马铃薯早疫病菌对代森锰锌的敏感性、产孢量以及AFLP基因型，揭示河北省马铃薯早疫病菌的遗传多样性，分析不同区域早疫病菌对代森锰锌的敏感性、产孢量和AFLP基因型之间的关系，为探讨河北省马铃薯早疫病菌近年来发生流行规律的变化以及防治提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌株：供试马铃

11、薯早疫病菌均由本研究室自田间采集的具同心轮纹的典型早疫病症状的病叶经组织分离法分离获得（方中达 1998）。供试菌株共计175株，其中河北省菌株包括3市11县共145株，河北省外的对照菌株30株，其采样时间、地点及菌株数目等信息见表1。1.1.2培养基及试剂：PCA培养基参考张天宇（2003）的配方，经改良后每1,000mL中含马铃薯20g和胡萝卜20g。80%代森锰锌为美国陶氏益农公司产品。1.2 代森锰锌对早疫病菌的毒力测定采用菌落直径法测定代森锰锌对早疫病菌的毒力，计算EC50（梁伟伶等 2009）。1.3 早疫病菌产孢量的测定将早疫病菌置于PCA培养基上，25光照培养（16h光照，8h

12、黑暗）7d（Fourtouni et al. 1998；Rotem & Esther 1969）。由于马铃薯早疫病菌产孢量很低，制成孢子悬浮液很难观测，所以本研究采用将培养皿直接置于显微镜下进行，每皿取20个视野（1010倍下每个视野下观察到的实际面积为0.25mm2）计算单位面积（mm2）分生孢子个数（n）。当0n40时，界定为I级；40n80，界定为II级；n80，界定为III级（Charlton 1953）。1.4 AFLP分析马铃薯早疫病菌基因组DNA提取采用改表1 供试马铃薯早疫病菌菌株的信息Table 1 Information of Alternaria solani colle

13、cted from potato in the test年份Year地点Location数量No.年份Year地点Location数量No.2010河北保定涞源Laiyuan, Baoding, Hebei62010河北张家口万全Wanquan, Zhangjiakou, Hebei112010河北承德丰宁Fengning, Chengde, Hebei82009河北张家口张北Zhangbei, Zhangjiakou, Hebei52009河北承德围场Weichang, Chengde, Hebei52010河北张家口张北Zhangbei, Zhangjiakou, Hebei202010河

14、北承德围场Weichang, Chengde, Hebei172009内蒙古呼伦贝尔扎兰屯Zhalantun, Hulunber, Inner Mongolia52010河北承德隆化Longhua, Chengde, Hebei12009内蒙古包头达茂Darhan Muminggan, Baotou, Inner Mongolia52010河北张家口尚义Shangyi, Zhangjiakou, Hebei172009陕西榆林定边Dingbian, Yulin, Shaanxi52010河北张家口怀安Huaian, Zhangjiakou, Hebei122009黑龙江齐齐哈尔克山Keshan

15、, Qiqihar, Heilongjiang52010河北张家口康保Kangbao, Zhangjiakou, Hebei122009黑龙江大兴安岭加格达奇Jiagedaqi, Da Hinggan Ling, Heilongjiang52010河北张家口崇礼Chongli, Zhangjiakou, Hebei162009云南昆明西山Xishan, Kunming, Yunnan52010河北张家口沽源Guyuan, Zhangjiakou, Hebei15良的CTAB法（Pipe et al. 2000）。AFLP反应体系参考Vos et al.（1995）和Martnez et al.

16、（2004）的方法，并略作改进。预扩增采用E+1和M+1引物组合（E-A/M-A），选择性扩增采用E+2和M+2的3对引物组合（E-AA/M-GA，E-AG/M-AG和E-AT/CC）。扩增产物采用毛细管荧光电泳技术进行分离检测。扩增条带采用生物学统计软件NTSYSpc 2.1进行分析。数据录入NT edit 1.2获得数据组，利用Similarity程序组中的SimQual程序计算相似系数（SM），利用SHAN程序采用不加权算术平均数法（UPGMA）对数据进行聚类分析，构建树状聚类图。2 结果与分析2.1 代森锰锌对早疫病菌的毒力测定毒力测定结果表明，马铃薯早疫病菌不同菌株对代森锰锌的敏感性

17、存在一定差异，其EC50介于1.044.86g/mL之间，平均为2.93g/mL，最敏感的菌株出现在河北承德围场，而最不敏感的菌株出现在河北张家口怀安。不同地区间菌株对代森锰锌的平均EC50也存在一定差异，河北万全最为敏感，平均EC50为1.77g/mL；河北怀安最不敏感，平均EC50为3.79g/mL（图1）。综上所述，尽管代森锰锌对不同地理来源菌株的毒力具有一定的差异，但都表现敏感，仍可作为生产上防治马铃薯早疫病的优选药剂。2.2 早疫病菌产孢量的测定本文测定了河北省张家口张北和承德围场共计47菌株和云南、内蒙古、黑龙江和陕西等四省6县的30个对照菌株的产孢量，结果表明，河北两县早疫病菌的

18、产孢量明显高于对照地区的产孢量（表2）。被测河北围场22株和张北25株菌产孢量范围分别为28160个孢子/mm2和44140个孢子/mm2，其平均产孢量分别为88个孢子/mm2和84个孢子/mm2。两地菌株产孢能力全部划分在II和III级，没有I级菌株出现。而黑龙江大兴安岭加格达奇、齐齐哈尔克山、内蒙古呼伦贝尔扎兰屯和云南昆明西山4地县区的菌株产孢量较小，平均产孢量分别为56、37、50和18个孢子/mm2。以上四地菌株全部划分为I或II级，未发现III级菌株。综合分析，河北省各县区马铃薯早疫病菌产孢能力（85个孢子/mm2）高于其他省份早疫病菌（50个孢子/mm2），菌株产孢差异与地理来源存

19、在一定的相关性。2.3 马铃薯早疫病菌AFLP基因型分析利用10株地理来源差异较大的菌株从36对选择性扩增引物组合中，筛选出3对多态性高、稳定性好的引物组合，对175株菌进行了AFLP扩增，共计扩增出231条谱带，多态性谱带为100%，这与Martnez（2004）的研究结果相同。AFLP聚类分析结果表明，被测马铃薯早疫病菌之间存在较大的遗传差异。在相似系数0.82时，被测菌株可划分为两大分支，即和（图2）。分支中共包含145株早疫病菌，其遗传差异较分支小。在相似系数0.85时，分支又可划分为A、B两组，A组由108个菌株组成，B组共37个菌株。其中，A可分为、 3个亚组，亚组含19个菌株，亚

20、组含23个菌株，亚组含66个菌株；B组可分为和两个亚组。分支共包含30株早疫病菌，与分支相比，其菌株间的遗传差异大，也可以分为C和D两个组。其中C组包含12株菌，D组包含18株菌。因此，AFLP分子标记可用于揭示马铃薯早疫病菌群体的遗传差异。图1 代森锰锌对马铃薯早疫病菌的毒力Fig. 1 Virulence of Mancozeb to Alternaria solani isolates.表2 马铃薯早疫病菌产孢量Table 2 Test of sporulation quantity of Alternaria solani collected from potato采集地点Locati

21、on菌株数目No.平均产孢量Average sporulation quantity (mm2)产孢级别 Level of sporulation capacityIIIIII数量No.百分比Percentage (%)数量No.百分比Percentage (%)数量No.百分比Percentage (%)河北围场 Weichang, Hebei2288001254.51045.5河北张北 Zhangbei, Hebei2584001248.01352.0黑龙江大兴安岭 Da Hinggan Ling, Heilongjiang556120.0480.000黑龙江齐齐哈尔 Qiqihar, H

22、eilongjiang537480.0120.000内蒙古呼伦贝尔 Hulunber, Inner Mongolia550240.0360.000内蒙古包头 Baotou, Inner Mongolia556005100.000陕西榆林 Yulin, Shaanxi56900360.0240.0云南昆明 Kunming, Yunnan518480.0120.000合计 Total77571114.34153.22532.52.4 马铃薯早疫病菌基因型与表型的关系2.4.1 基因型与地理来源之间的关系：AFLP数据所构建的聚类树状图分为和两大分支，分支共包括早疫病菌145株，其中河北省菌株141

23、株，4株为外省对照菌株。而在分支共包含早疫病菌30株，其中河北省外对照菌株26株，河北省菌株仅4株。在分支A组中，共包含108株早疫病菌，其中101株菌采自河北省张家口市所属各县，占绝大多数（93.5%）。另7株分别为内蒙古包头达茂旗1株，内蒙古呼伦贝尔扎兰屯3株，河北保定涞源3株。而B组所包含37株菌均采自河北省，其中承德31株，占B组全部菌株的83.8%，张家口怀安3株，保定涞源3株。在分支A组的亚组所有19株菌中，其中17株采自张家口尚义，其他2株为张家口康保所属。亚组23株菌全部采自张家口张北。亚组共66株菌，其中59株为河北张家口所属各县菌株，占89.4%。分支B组37株菌全部采自河

24、北省。B组的亚组所包含的23株菌，均采自承德市各县，其中围场21株，丰宁1株，隆化1株。亚组包含的14株菌，地理来源相对较为分散，其中主要为承德丰宁7株，其次保定涞源3株，张家口怀安3株，承德围场1株。综上所述，每个分支、分组和亚组都代表着某个区域范围内早疫病菌的优势基因型，如分支代表河北省早疫病菌的优势基因型；A组表示河北张家口早疫病菌优势基因型，亚组为张家口尚义早疫病菌优势基因型。故马铃薯早疫病菌AFLP基因型与地理来源存在着密切的相关性。2.4.2 基因型与产孢量的关系：分支菌株产孢量明显高于分支。分支共测定了51株早疫病菌的产孢量，产孢水平均为II或III级，其数量分别为28株和23株

25、，占总数的54.9%和45.1%。而分支26株被测菌株的产孢量差异比较大，I、II和III级均存在，其中I级11株，占总数42.3%；II和III级菌株数分别为13株和2株，分别占50.0%和7.7%。A组共测定了29株菌的产孢水平，产孢量高，产孢水平为II和III级，其数量分别为16株和13株，分别占55.2%和44.8%。B组共测定22株，产孢水平与A组相似，产孢水平均为II和III级，数量分别为12株和10株，分别占54.5%和45.5%。因此，马铃薯早疫病菌AFLP基因型和产孢量存在一定程度的相关性。2.4.3 基因型与毒力的关系：有关代森锰锌对早疫病菌的毒力，分支中EC50介于1.0

26、44.70g/mL之间，分支中EC50介于1.874.86g/mL之间，两分支大多数菌株间EC50相互重叠。此外，代森锰锌对、分支分组以及亚组的早疫病菌的毒力大小分布无一定顺序分布规律。因此，马铃薯早疫病菌AFLP基因型与代森锰锌对其毒力之间不存相关性。3 讨论AFLP分子标记可以揭示马铃薯早疫病菌丰富的遗传多样性。3对AFLP引物组合在被测175株早疫病菌中共扩增出了231条谱带，多态性谱带比例为100%，可以作为早疫病菌菌株分型鉴定的指纹图谱。该研究揭示的早疫病菌遗传多样性与Weir et al.（1998）利用RPAD标记技术对美国早疫病菌的遗传多样性相比要大得多；而与Martnez e

27、t al.（2004）利用AFLP标记技术对古巴、巴西、美国等国家早疫病菌的遗传多样性研究结果一致。本研究中所揭示的早疫病菌的基因型丰富的多态性，与供试材料取样相对广泛以及采用先进的毛细管荧光电泳检测技术密切相关（王辉和林炳承 2002），也表明了荧光标记的AFLP可很好地揭示病原菌群体的遗传多样性。物种的遗传变异与其生存的地理生态环境之间的关系一直是物种群体遗传学演化普遍关注的焦点问题。一些研究认为链格孢属某些种的基因型与其地理来源之间存在一定的相关性（Sharma & Tewari 1998；Morris et al. 2000；Martnez et al. 2004）。而本研究结果表明马

28、铃薯早疫病菌AFLP基因型与地理来源存在密切的相关性，在AFLP聚类分支图中，每一层次分支都具有各自的优势群体，且与地理来源密切相关。例如：分支为河北省所属的优势群体，在其内部A组为张家口所属的优势群体，而B组包括绝大多数承德市所属的优势群体。在A组内部的亚组以张家口尚义菌株为优势群体，亚组以张家口张北菌株为优势群体。同样，在分支C组中共包含12株早疫病菌，其中黑龙江省10株，占绝大多数。这一现象可能由于马铃薯早疫病菌产孢量较少（Fourtouni et al. 1998），孢子跨区域长距离传播的能力较低（Martnez et al. 2004），早疫病菌在当地经过长期的有丝分裂，已定殖形成特

29、定的优势群体，各区域之间菌株的基因交流较少，从而造成了各区域早疫病菌间存在明显不同的基因型。而近年来随着种薯调运等人为因素的干扰，造成了各地菌株的不规律人为迁移（Aradhya et al. 2001），因而，不同地区出现了一定程度的多样性。但由于地区内部早疫病菌的群体优势明显，其优势基因型仍占主导地位，类似情况也曾在A. alternata的报道中出现（Weir et al. 1998；Guo et al. 2004）。有研究表明，病原菌产孢量与病害的流行密切相关（Johnson & Taylor 1976；Xu & Ridout 1998）。在产孢量实验中，马铃薯早疫病菌产孢量不高，这与前

30、人的研究结果（Charlton 1953；Fourtouni et al. 1998）和发病叶片直接在显微镜下观察所得到的结果是一致的。马铃薯早疫病菌的产孢量（5085分生孢子/mm2）远远低于晚疫病（2464,346孢子囊/mm2）等其他马铃薯真菌病害病原菌的产孢量（Guo et al. 2002），使其很难在短时间内大规模爆发和流行。供试河北省围场和张北两县早疫病菌产孢量大于对照省份菌株的产孢量，这一结果也解释了近年来河北省围场、张北等部分地区早疫病发生和流行日趋严重的原因。所有供试马铃薯早疫病菌对代森锰锌均表现敏感，这主要是由于代森锰锌作用位点多（Staub & Sozzi 1984）、

31、抗性风险低、防效高等特点（Russell 1995）。同时，本研究结果与Shtienberg & Blachinsky（1996）和梁伟伶等（2009）报道的代森锰锌对早疫病菌毒力的研究结果一致。但不同菌株之间对代森锰锌敏感性水平表现出一定的差异，这种差异可能是由于菌株个体之间遗传差异和实验系统误差而造成的（Kumar et al. 2008）。病原菌对代森锰锌的敏感性与AFLP基因型无相关性，与Adachi et al.（1996）报道的链格孢对杀菌剂抗性与RAPD基因型无关的结果一致，主要是因为RAPD和AFLP基因型揭示了病原菌整个基因组水平的遗传变异，而病原菌对代森锰锌的敏感性差异仅仅

32、反映了极少特定基因的差异，因此，病原菌的基因型与其对药剂的毒力无相关性（Kolmer et al. 1995；Vos et al. 1995）。本文研究结果表明，河北省马铃薯早疫病菌AFLP基因型具有明显的分化现象，其基因型分化与地理来源存在着密切的相关性，而与菌株产孢量存在一定的相关性，但与代森锰锌对菌株的毒力无相关性。REFERENCESAdachi Y, Watanabe H, Tsuge T, 1996. Relationships between genetic polymorphisms and fungicide resistance within Alternaria alte

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