实验1 特殊显微镜结构及操作技术.ppt

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1、实验1 特殊显微镜结构及操作技术,【目的】 了解TE2000-U型倒置显微镜的基本组件、原理，掌握其基本操作。【材料】 1高等动、植物各类组织永久制片； 2培养皿（瓶）中的活细胞或微生物； 3口腔上皮细胞的临时装片。,【实验用品】,1试剂：10g/mL罗丹明123的磷酸缓冲液（PBS）荧光染料。2器材：倒置显微镜，相差显微镜附件（相差物镜、转盘聚光器、对中环形光阑和绿色滤色镜等），微分干涉显微镜附件（起偏镜、检偏镜和渥拉斯顿棱镜等），荧光显微镜附件（荧光发射器、激发滤片和阻断滤片等），载玻片，盖玻片，牙签，滤纸条，擦镜纸，镊子，滴管。,【实验原理和方法】,倒置显微镜是一种用于生物组织细胞离体培

2、养观察的光学显微装置，能直接对培养皿、培养瓶的标本进行显微观察。由于它的物镜、物体和光源位置刚好与立式显微镜颠倒，被称为倒置显微镜。倒置显微镜的物镜在下，聚光器在上，被观察样品置于位于上方的聚光器之下，聚光器具有远大于物镜的工作距离。因此，适应于培养皿或培养瓶中样品的观察。高档倒置显微镜可根据不同观察要求，增加相差、微分干涉反差物镜或荧光发射装置，构建成相差显微镜、微分干涉显微镜或荧光显微镜。,一、倒置显微镜的构造与使用,（一）倒置显微镜的构造倒置显微镜由目镜、透射照明器、聚光器、载物台、物镜和显微镜机体等部件构成，以TE2000-U显微镜为例介绍。TE2000-U 显微镜配有：T-DH 10

3、0W 透射照明器、LHS-H100P-1 12V100W 灯室、12V100W 卤素灯、TE2-PS100W 电源、T-SR 矩形载物台、T-TD 双目镜筒D、CFI 10X 目镜、T-N6 六孔物镜转换器，系统聚光器、物镜、电源线等。,1. 目镜筒及目镜 A:屈光度调节环 B:目镜 C:目镜筒转盘O:开 B:勃氏镜(带有聚焦螺钉) C:关(光闸) M:2.5 倍放大,2. 显微镜机体,3. 透射照明器: 透射照明器必须根据规定使用灯泡(12V100W 或6V30W)。T-DH 100W 透射照明器需灯室。,A： 视场光阑调节杆 B： 滤色片滑片C： 聚光器再聚焦制动器 D： 聚光器调焦旋钮E

4、： 聚光器固定螺钉 F： 聚光器安装定位孔G： 聚光器安装定位槽 H： 聚光器转动指紧螺钉I： 聚光器调中螺钉 J： 聚光器安装(可转动)支架K： LHS-H100P-1 12V100W 灯室 L： 灯室固定螺钉M： 灯室盖指紧螺钉 N： 聚光器支架(可移动)O： 聚光器支架指紧螺钉 P： 灯室线Q： 聚光器支架下降定位螺钉,T-DS 30W 透射照明器 A： 防尘滑片(可移动) B： F 堵口滑片(可移动) C： 聚光器安装支架 D： 6V30W 灯室 E： 滤色片滑片 F： 安装附加装置M4 螺纹孔,系统聚光器,T-DH 100W 透射照明器 A： 聚光器孔径光阑B： 聚光器模块C： 聚光

5、器模块固定螺钉D： 聚光镜(有三种可选：ELWD、LWD、HMC)E： 环形光阑调中螺钉(仅用于相差模块中),T-DS 30W透射照明器(霍夫曼观察),ELWD-S 聚光器,A：调中杆指紧螺钉B：调中杆 C：转盘,SLWD 聚光器,T-SR矩形载物台,A：载物环湾 B：载物台Y 轴方向移动控制旋钮 C：载物台X 轴方向移动控制旋钮,（二）由TE2000-U，100W 透射照明器，系统聚光器，以及T-TD 目镜筒D 组成的显微镜系统。,明视场(BF)镜检关键点： 从光路中卸下其它形式观察需要的所有光学组件，聚光器调节好（调节聚焦和对中），转动孔径光阑调节好像的清晰度。,1. 复位,1） 逆时针转

6、动，松开透射照明器中的“聚光器再聚焦指紧螺钉”。2） 把“目镜筒转盘”设置到O位。3） 把显微镜右侧的“中间放大倍数刻度盘”打到1X。4） 逆时针转动，松开显微镜右侧粗微调旋钮后面的“物镜再聚焦定位环”,2. 打开透射照明器,1） 把电源后部的“外部开关”打到开的位置；2） 把电源“电源开关”打开。(把开关拨至)；3） 按下显微镜左侧的“照明器开关”接通灯泡。,3. 调节灯泡亮度保证色彩真实。,1） 把显微镜左侧的“亮度调节盘”设置成12V100W；2） 把透射照明器中的“NCB11 滤色片”插入光路中；3） 把透射照明器中的“ND4 滤色片”插入光路中。,4. 调节光路,1） 把10X 物镜

7、转到光路中。2） 把显微镜右侧的“光路转换盘”转到1的位置。（100%光到观察口）3） 向上推透射照明器上的“视场光阑杆”完全打开视场光阑。4） 将系统聚光器上的“孔径光阑杆”转至右侧极限处把“孔径光阑”完全打开。5） 转动聚光器调焦旋钮把聚光器调至最低位置。,5. 明视场观察时对显微镜的调整,把“聚光器转盘”转到A位置。,6调节视度及瞳距,1）将显微镜前部的“摄影取景框转盘”逆时针旋转，使摄影取景框进入光路。2）用左眼对着左侧目镜，转动目镜 “屈光度调节环”，使取景框中的双十字线清晰成像。3）用右眼对着右侧目镜，转动目镜 “屈光度调节环”，使取景框中的双十字线清晰成像。4）将显微镜前部的“摄

8、影取景框转盘”顺时针旋转，使其退出光路。5）调节目镜瞳距，将两目镜视场所见的影像重合在一起。,7. 调焦,1）将样品放置载物台中。2）转动同轴粗微调旋钮，将标本对好焦。,8. 聚光器中心调节,1）确信10X 物镜在光路中。2）将“视场光阑调节杆”降低直到能从目镜看到视场光阑像。3）转动“聚光器调焦钮”升降聚光器，使视场光阑像清晰地成象在标本面上。4）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在视场中心。5）更换40X 物镜。6）调节“视场光阑调节杆”，使视场光阑的象与视场大致相同。7）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在视场正中。,9. 进行观察,1）选择要使用的物镜2）移动系统聚

9、光器上的“孔径光阑调节杆”，使孔径为物镜数值孔径的7080%。（“把目镜筒转盘”设到B位置，转动勃氏镜调焦螺钉使其聚焦，当观察到物镜的出瞳和孔径光栏的象时，调节其大小。）3）调节“视场光阑调节杆”使视场光阑像与视场相大致相同。4）把透射照明器里的“ND 减光片”进入或退出光路以调节视场亮度。,10. 更换样品,利用显微镜主体上的“物镜再聚焦定位环”，照明器上的“倾斜装置”，“聚光器再聚焦指紧螺钉，可容易更换样品。,11. 显微镜操作结束后,1) 关闭电源开关(开关拨至O)2) 灯室冷却后，把显微镜上的聚乙烯防尘罩盖好。,相差（PH）显微术,观察透明细胞或其他透明样品，需配相衬聚光器、相衬物镜、

10、相衬环等附件。相衬板将衍射光推迟1/4波长，振幅相减，样品暗，背景亮，称正反差或暗反差，分正低（DL）、正低低（DLL）和中型暗相差（DM）。折光率较强的样品用后者。相衬板将直射光推迟1/4波长，振幅相加，样品亮，背景暗，称负反差或明反差，分负中（NM）和负高（NH）。折光率较小的样品用后者。,关键点：将有ph 标记的物镜与物镜相同ph 标记的聚光器模块一起送入光路，在进行显微术前，校正(对中)物镜里的相差板及聚光器模块里的环形光阑。,1. 用明视场（BF）显微术对样品聚焦。2. 相差观察时对显微镜的调整。,1) 将ph 物镜转入光路。2) 转动“聚光器转盘”，使其与在光路中的物镜(步骤1中所

11、安置的)具有相同的ph 标记。3) 向右转动聚光器上的“孔径光阑调节杆”，完全打开孔径光阑。,3. 对中环形光阑,1) 把“目镜筒转盘”设到位置，转动勃氏镜聚焦螺钉，使环形光阑像清晰。2) 用六角起子转动聚光器模块中的两个“环形光阑对中螺钉”，使环形光阑像与物镜中的相差板环形像同心。3) 把目镜筒转盘位置再转到上。调中心手轮,4. 进行观察,1) 把聚光器“孔径光阑”完全打开。2) 移动透射照明器上的“视场光阑调节杆”，使视场光阑像大小与视场大小接近。3) 把透射照明器上的“NCB11 滤色片”从光路中移开，把“GIF 滤色片”移进光路。(提高反差)4) 可通过把“ND 滤色片”移进或移出光路

12、来调节视场亮度。,5. 使用不同放大倍数的物镜进行观察,1) 把所需放大倍数的相差物镜移入光路。2) 转动“聚光器转盘”，使其与在光路上物镜（步骤1中所安置的）具有相同的ph 标记。3) 调节放入光路中的环形光阑中心。(见程序3),6. 更换样品利用使用显微镜主机上的“物镜再聚焦定位环”，透射照明器上的“倾斜”装置及“聚光器再聚焦指紧螺钉”，可容易更换样品。7. 显微镜操作结束后与明视场显微术步骤相同。,微分干涉（DIC）显微术,可观察到样品的立体感，适用于显微操纵等，彩色图像。因塑料培养皿的不均衡张力在DIC下呈现干涉条纹、DIC不宜用于普遍使用的塑料培养皿。DIC的光通亮大，可用到100倍

13、物镜。需配DIC聚光器等附件，使用明场物镜。1用明场找到视野2压入起偏器，选择相应模块3调节孔径光栅至最佳效果。,荧光（E）显微术,适用于本身属于或被染色后形成荧光体的样品。荧光体在一定波长光（紫外或可见）的激发下发光（即荧光，波长长于激发光）。需配荧光附件和滤光器等。前者主件为激发光源，一般分汞灯系统和卤灯系统，汞灯既适用于紫外光激发也适用于可见光激发，且能量较高；后者只适用于可见光激发。（此处插入拍摄图片）,1. 操作之前要求：,（1）检查荧光装置的工作时间，如荧光灯的工作时间超过使用寿命，应予以更换。（2）使用物荧光载波片（3）每次使用之间必须间隔20分钟。,2. 用明场找到视野。3. 关闭明场光源，打开荧光电源预热5分钟。4. 开启荧光盘，并根据要求选择荧光通道。5. 激发荧光发生器，打开光闸，即可进行观察。,