单克隆抗体.doc

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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流单克隆抗体.精品文档.单克隆抗体的制备生物工程0712 许文俊 2007221061摘要: 利用细胞融合技术将经抗原致敏且能分泌某种抗体的B 淋巴细胞与能够长期生长的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种融合的杂交瘤细胞称为B 淋巴细胞杂交瘤细胞。由于每一个产生抗体的细胞只能产生单一特异性抗体，因此杂交瘤细胞即具备了B 细胞产生特异性抗体的能力，同时又保留了瘤细胞长期增殖的特性的原理，进行单克隆抗体的制备关键词: 单克隆抗体、细胞融合、制备过程一、单克隆抗体的概念单克隆抗体：一种抗体分子是由一个B 淋巴细胞分化增殖而形成的浆细胞系产生的。由一个细

2、胞增殖而形成的具有相同遗传特征的细胞群叫做“克隆”。由一个浆细胞大量增殖形成的克隆产生的抗体称单克隆抗体（Monoclonal atibody，McAb）。这种抗体分子组成均匀，特异性单一。用杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体纯度高、专一性强、效价高，使用时可免除不同细胞及微生物种或株间血清学上的交叉反应，大大提高了诊断的特异性及敏感性。另外，在研究细胞表面标志、提纯可溶性抗原、进一步研究抗体的结构和功能等方面都起着十分重要的作用。二、单克隆抗体技术的历史1970 年Sinkovics 等人报导产生特异性病毒抗体的淋巴细胞和由病毒引起的肿瘤细胞可以自然地在体内形成杂交瘤分泌特异性抗体。1973 年

3、Schwaber 与Coken 首次报导了鼠人杂交瘤的成功。1974 年Bloom 与Nakamura 首次应用人的B 细胞与人的骨髓瘤细胞融合产生淋巴因子。1975 年，Kohler 和Milstein 应用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊细胞致敏的小鼠脾细胞融合，得到的一部分融合杂交细胞既能继续生长，又能分泌抗羊红细胞抗体，将这种杂交细胞系统称为杂交瘤，应用这种方法可制备单一抗原决定簇的单克隆抗体，创立了单克隆抗体技术， 获1984 年诺贝尔奖。1978 年Miller 与Lipman 应用EB 病毒转形人的B 淋巴细胞产生单克隆抗体，使杂交瘤单克隆抗体技术向前迈进了一步。1980 年Luben 与M

4、olle 证明，在体外培养10 天的小鼠胸腺细胞能够产生淋巴因子，并能代替在体外培养中产生初次免疫（primary immunization，也称原发性免疫）反应所需要的免疫T 细胞。他们应用这种胸腺细胞培养液（称为条件培养液）加到小鼠脾细胞培养物中，并加入抗原（淋巴因子破骨细胞激活因子）刺激脾细胞产生免疫反应，随后用这种细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交而产生破骨细胞激活因子的单克隆抗体，建立了体外初次免疫反应，缩短了在体内免疫的时间。三、单克隆抗体制备原理用细胞融合技术将经抗原致敏且能分泌某种抗体的B 淋巴细胞（免疫动物B 细胞）与能够长期生长的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种融合的杂交瘤细胞称为B

5、 淋巴细胞杂交瘤细胞。由于每一个产生抗体的细胞只能产生单一特异性抗体，因此杂交瘤细胞即具备了B 细胞产生特异性抗体的能力，同时又保留了瘤细胞长期增殖的特性。在HAT 培养基的选择作用下，只有融合成功的杂交瘤细胞才能顺利生长，经过反复的免疫学检测和大量细胞培养，最终获得既能产生所需抗体、又能不断繁殖的纯系杂交瘤系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其后产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。四、单克隆抗体制备过程1、抗原制备2、免疫动物免疫动物的目的免疫动物的目的是为了取得分裂活跃并能产生特异性抗体的 B 淋巴细胞，增加分泌特异性抗体的杂交瘤频率，并使B 细胞在抗原的刺激下分化，有利于细胞融

6、合形成杂交瘤细胞。免疫动物的选择免疫动物的选择主要取决于所用融合的骨髓瘤细胞系，选择BALB/c 健康小鼠，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c 小白鼠系诱导出来。Balb/c 系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以812周龄为宜。因其与融合用的本亲骨髓瘤细胞呈同源性，组织相容性一致融合后所得到的杂交细胞注入同系小鼠腹腔后，即不受排斥又可形成腹腔肿瘤和诱生腹水，产生高效价的McAb。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫34 只小鼠。免疫动物的抗原对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆

7、抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。免疫动物的过程免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.01075.0107 种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B 淋巴细胞大量增加。B 淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B 淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后78 天，虽然是抗体产生的高峰

8、时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。细胞抗原：可取12107 个细胞作腹腔或静脉注射。可溶性抗原：如蛋白质，1 次剂量10100mg/只，需加等量完全弗氏佐剂并经充分乳化，腹腔或小鼠颈背部多点注射。如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。对于来源困难，又难以提纯的抗原，可作脾直接注射法。注射20mg 蛋白抗原或2.5x105 个细胞，一次免疫后34d 即可取脾细胞进行融合。免疫间隔一般23

9、 周。末次免疫后34 天，分离脾细胞融合。可溶性抗原免疫小鼠，第一次免疫：24 只8 周龄BALB/c 小鼠同时免疫。1015mg 抗原与弗氏佐剂等体积混合，皮下多点或腹腔注射。加强免疫：第二次免疫，抗原量减半，并改用弗氏不完全佐剂。加强免疫可行多次，直至血清效价达到要求。冲击免疫：最后一次免疫，用PBS150ml溶解抗原50mg，经小鼠尾静脉注射。免疫效果检测：免疫23 次后取血用ELISA 法检测血清效价。3、骨髓瘤细胞的制备选择骨髓瘤细胞的条件两者同系稳定，易培养自身不分泌免疫球蛋白融合率高是HGPRT 缺陷株生长速度快，繁殖时间短。用于融合试验的骨髓瘤细胞系的来源现有的小鼠骨髓瘤细胞株

10、大多数是 MOPC-21 细胞株的后代，这株骨髓瘤细胞是由Horibata 和Harris 在体外培养成功的，命名为P3K。它的HGPRT 缺陷细胞亚株在Milstein 实验室建立，简称为X63。Kohler 等人又进一步诱发产生了一株丢失免疫球蛋白重链的变异细胞亚株，简称为NS-1，随后又进一步诱发出完全不分泌免疫球蛋白的P3.653 和SP2/0 等。骨髓瘤细胞的制备应用最多的是 Sp2/0 细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，细胞的最高生长刻度为9105/ml，倍增时间通常为1015h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95）。为了防止出现返祖现象，骨髓瘤

11、细胞株在融合前应先用含15g/ml 8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养（即培养15h20h） ，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2x105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。骨髓瘤细胞的培养和保存注意事项1）选择对数生长期的细胞进行传代培养2）防止突变，定期筛选，避免细胞返祖3) 切忌过多的传代培养4) 防止支原体污染4、饲养层细胞的制备饲养细胞：融合成功的杂交瘤细胞很少，加入滋养细胞可帮助杂交瘤细胞生长，而滋养细胞本身生长一段时间后会自然死亡。加入的细胞称之为饲养细胞。（Feeder cell）。主要有小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠胸腺细胞。应用腹腔巨噬细胞的优点：做饲养细胞，巨噬细胞可以吞噬

12、死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。取小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞（1）取一只68 周的健康Balb/c 小鼠，拉颈处死。（2）按无菌操作剪开皮肤，应注意不要剪破腹膜。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。（4）用注射器将5ml 无血清培养液注入腹腔，用手指轻揉1min 仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。（5）1 000rmin 离心10min。（6）去上清，以HAT 选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，饲养细胞调至4105/ml 个活细胞。（7）将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2 万个细胞，放入CO2 培养箱培养，即可供细胞融合和克

13、隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染5、脾细胞的制备(1) 冲击免疫后3 天，摘除小鼠眼球放血。(2) 血清留作阳性对照。(3) 按无菌操作规程取出脾脏，压碎研磨,加入无血清的培养液，用100 目的不锈钢网过滤。(4) 细胞计数，活细胞数应高于80，取1x108 个细胞置室温待用 。6、细胞融合细胞融和的概念通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）。 诱导细胞融合的方法：化

14、学方法（聚乙二醇PEG）细胞融合剂聚乙二醇融合法：1974 年Kao 首先用PEG 成功的诱导植物细胞融合。1977 年Galgre 将PEG用于淋巴细胞杂交瘤技术获得满意的结果，从而PEG 成为该技术中应用最广的融合剂。 聚乙二醇（PEG），在分子量为200700 时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000 时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000 者，常用浓度为50，pH8.0pH8.2（用10NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操

15、作。50浓度，pH 偏碱时融合效应最高。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。细胞融合应注意的问题细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从 1:2 到1:10 不等，常用1:4 的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min 滴加4.5ml 培养液；间隔2min 滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。细

16、胞融合操作方法 准备好脾细胞。 在50ml 沉淀管中混合108 脾细胞和107 小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml 2.5FCS1640 液。 室温400g 离心3min，使细胞沉淀。 移去上清液。 轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40水浴中，使其达融合温度。 加预热至40的50PEG 0.8ml，用1ml 吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。 加1ml1640 液，边加边摇动，持续1min。重复一次。 加1ml 1640 液，边加边摇动，持续0.5min。 重复一次。 加1640 液15ml。 室温，400g 离心1min，使细胞沉淀。去上清，轻敲

17、管底部，加25ml 含有HAT 的完全1640 液。 往已于前一日种有饲养细胞的40 孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1 滴（约0.05ml）。 轻摇后，放入5CO2 饱和湿度的37温箱中培育。 第3、6、9、10 日换入含HAT 的完全1640 培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。 于第12、15 日加入含有HAT 的完全1640 培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10 天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在1020 天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。 对继续生长的杂交瘤

18、细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT 液和完全1640液而代之以10%FCS1640 液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失7、杂交瘤细胞的选择性培养选用HAT 选择性培养的目的免疫小鼠的脾细胞及小鼠骨髓瘤细胞经融合剂作用后，形成具有五种细胞成分的复合体。除了所需要的杂交瘤细胞外，还包括骨髓瘤细胞之间或脾细胞之间互相融合而成的四倍体细胞以及未融合的骨髓瘤细胞及脾细胞，这些细胞都应被清除。采用加有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的HAT 选择性培养基，即可达到选择保留所需的如何细胞的目的。HAT 选择性培养的原理在含

19、有 HAT 的培养液中，细胞合成核酸的主要途径被氨基喋呤所阻断，而用于细胞融合的骨髓瘤细胞均经8-氮鸟嘌呤筛选而缺乏HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK（胸腺嘧啶核苷激酶），因此它们合成核酸的补救途径也被阻断，；脾细胞虽然含有HGPRT,但他们在体外只能存活57d；只有骨髓瘤细胞与脾细胞融合后所形成的杂交瘤细胞，因能从脾细胞中获得所缺乏的酶类，又有组织培养条件下生长能力，故在含有HAT 的培养液中通过补救途径合成核酸而继续生长繁殖。HAT 选择性培养的方法将经PEG 处理并在CO2 孵箱培养24h 的融合后的细胞悬浮于HAT 培养液中，再送回到CO2孵箱培养。每23d 更换培养液

20、一次，每次先自个培养孔轻轻吸去一半上清液，1 周或改用HT 培养液，2 周后改用15%小牛血清的完全培养液。8、杂交瘤细胞的筛选融合后的细胞在含有HAT 培养基中培养后，即有部分培养孔出现杂交瘤集落，但其中仅部分是分泌针对预定特异性抗体的杂交瘤细胞。在培养710d 后，用低倍镜观察，杂交瘤细胞的集落长成约占1/31/2 视野面积时，即可取培养上清进行特异性抗体的检测，确定有无分泌McAb 的能力，以便及时进行细胞克隆化。检测的方法：间接血凝试验；酶联免疫吸附试验；放射免疫测定；间接免疫荧光测定9、杂交瘤细胞的亚克隆化经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗

21、体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要35 次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。10、单克隆抗体的鉴定1） 杂交瘤细胞染色体的检查 采用秋

22、水仙素裂解法进行。2） 单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig 类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA 夹心法测定单抗的Ig 类型和亚型。3） 单抗的特异性鉴定 可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA 法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。4） 单抗的效价测定 可采用凝集反应、ELISA 或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5104。而采用ELISA 检查，腹水效价可达1.0106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。5） 必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。11、单

23、克隆抗体的大量制备增量培养法筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。增量培养法，即将克隆化的细胞在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，且不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。小鼠腹腔接种法最普遍采用的方法。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。选用BALB/c 小鼠或其亲

24、代小鼠，先用降植烷或液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集510ml 的腹水，有时甚至超过40ml。小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的1001 000 倍。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当，一般为5105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。12、杂交瘤的冷冻保存及复苏选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于

25、液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在70冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲基亚砜（DMSO）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在5095之间。如果低于50，则说明冻存复苏过程有问题。五、单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析等步骤达到纯化目的。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和层析纯化法。六、单克隆抗体的应用1、特异性抗原的发现及提纯2、单克隆抗体的导向治疗3、病理组织定位诊断中的应用4、用于淋巴细胞分类、鉴定、结构与功能的研究5、临床生化诊断中的应用6、应用抗T 细胞McAb 可防止器官移植排斥反应及治疗某些自身免疫病。参考文献：细胞工程 殷红主编 2006年9月细胞工程 罗立新主编 2003年动物细胞工程 徐永华主编 2003年动物细胞工程学 周欢敏主编 2009年5月单克隆抗体 K.西科拉 H.M.史沫特莱著 范培昌 秦德安译 1987年单克隆抗体的制备及其应用研究进展 泮结超石君帆 浙江省医学科学院学报 2009 年9 月