（本科）18第8章 转录物组miRNAppt课件.ppt

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1、课程主讲人：（本科）（本科）18-第第8章章 转录物组转录物组-miRNAppt课件课件- - 1) 1) 植物转基因沉默植物转基因沉默 2) 2) 线虫线虫RNARNA注射实验注射实验 3) 3) 线虫发育突变研究线虫发育突变研究1989年年Matzke等将控制紫色花的基因导入矮牵牛细胞等将控制紫色花的基因导入矮牵牛细胞, 获得再生植株。由获得再生植株。由于于 导入矮牵牛的转基因含有导入矮牵牛的转基因含有反向尾反向尾-尾重复尾重复的结构，产生的结构，产生正义和反义基因正义和反义基因转录产物转录产物，基因转录产物形成，基因转录产物形成dsRNA, 导致转基因和导致转基因和内源基因的沉默内源基因

2、的沉默,使原使原本产生紫色花色的花瓣变成白色本产生紫色花色的花瓣变成白色. 这是首次双链这是首次双链RNA导致基因沉默导致基因沉默. 称之称之为为转录后基因沉默转录后基因沉默 (PTGS)。Dr. Marjori Matzke Dr. Antonius MatzkeFireFire等，等，Nature 391: 80611，1998RNARNA干扰实验干扰实验：a)a)负对照负对照线虫胚线虫胚 胎胎，未注射，未注射RNARNA , ,无探针杂交。无探针杂交。b)b)未注射未注射线虫胚线虫胚 胎胎，探针杂交，探针杂交， 显示强杂交信显示强杂交信 号内源号内源mRNAmRNA。 c)c)单链反义单

3、链反义RNARNA注注 射线虫胚胎，射线虫胚胎， 弱杂交信号弱杂交信号。d)d)纯化纯化双链反义双链反义 RNA RNA注射线虫注射线虫 胚胎，内源胚胎，内源目目 标标RNARNA完全降解完全降解。1 1）秀丽线虫是）秀丽线虫是模模 式生物式生物。雌虫。雌虫 含含959959个体细个体细 胞，雄性成虫胞，雄性成虫 只有只有10311031个体个体 细胞。细胞。2 2）线虫从）线虫从一个受一个受 精卵精卵发育发育到成到成 虫需经历阶虫需经历阶4个个 幼虫阶段幼虫阶段和和一一 个成虫阶段个成虫阶段， 受基因调控受基因调控。1988年夏年夏Abros小组小组克隆克隆影响线虫幼虫发育影响线虫幼虫发育l

4、in-4基因基因， lin-4基因突变基因突变阻止线虫从阻止线虫从L1期进入期进入L2期期。他们。他们 发现发现lin-4可能编码非编可能编码非编RNA。 Cell 57: 49-57，19891993年年Ruvkun实验室实验室克隆克隆到线虫到线虫突变基因突变基因lin-14 ， lin-14突变突变使使L4期线虫期线虫多蜕一次皮多蜕一次皮。lin-14基因基因3 末端与末端与lin-4基因基因3末端有互补序列末端有互补序列。 Cell 75:843-54，19932000年年Ruvku G等采用定位克隆分离到等采用定位克隆分离到let-7基因基因。 let-7基因基因编码小编码小RNA，可

5、使，可使lin-41基因沉默基因沉默，使，使幼虫过早进入成虫期。幼虫过早进入成虫期。这些小这些小RNA现在被称为现在被称为microRNA，即，即miRNA。Nature 403:901-905Nature 403:901-905，20002000线虫的发育受时序调控基因控制：线虫的发育受时序调控基因控制：L1L1末期：末期：lin-4lin-4表达上调，表达上调，lin-14lin-14 mRNAmRNA水平水平降低降低，幼虫进，幼虫进 入入L2 L2 期。期。 L3/L4L3/L4期：期：lin-7lin-7表达上调使表达上调使l lin-41 in-41 mRNAmRNA水平水平降低降低

6、，幼虫进，幼虫进 入成虫期。入成虫期。Lin-14Lin-14，Lin28, Lin-41Lin28, Lin-41和和Lin-29Lin-29，编码，编码蛋白质基因蛋白质基因。Lin-4Lin-4，Let-7Let-7，编码编码干扰干扰RNARNA基因基因。lin-4和和lin-7与靶与靶mRNA之间有多种互作方式之间有多种互作方式.Nature 403:901-905, 2000lin-4和和lin-7基因的转录产物为基因的转录产物为RNA，在细胞中可形成，在细胞中可形成茎环茎环结构结构，并，并加工成加工成22 nt 双链小双链小RNA。上图显示。上图显示lin-7转录产转录产物与被调控的

7、物与被调控的lin-14基因基因3-端的端的7个重复序列互补个重复序列互补。 Cell, 1993, 75:843-541 1）AmbrosAmbros实验室利用分子杂交发现在线虫不同龄实验室利用分子杂交发现在线虫不同龄 期幼虫，存在两种大小的小期幼虫，存在两种大小的小RNARNA：22-nt22-nt和和65-65- nt nt， 22-nt 22-nt是功能小是功能小RNARNA终产物终产物。2 2）BartelBartel实验室在线虫，果蝇和人体细胞中发现实验室在线虫，果蝇和人体细胞中发现 存在许多类似存在许多类似lin-4lin-4和和let-7let-7的的保守的小保守的小RNARN

8、A。AmbrosAmbros实验室以及实验室以及BartelBartel实验室分别对上述长度实验室分别对上述长度为为21-24 nt21-24 nt，具有干扰靶基因表达的小，具有干扰靶基因表达的小RNARNA取名取名为为microRNAmicroRNA。Science 294Science 294：862862，2001 2001 Science 294 Science 294：858, 2001858, 2001miRNA基因首先转录成基因首先转录成 pri-miRNA，在细胞核在细胞核内形成内形成茎环茎环结构结构。茎环茎环结构被结构被DGCR8识别识别，随后由随后由Drosha在基部在基部

9、切切离离并并释放释放pre-miRNA。c，d) pre-miRNA进入细胞进入细胞质质与与RNaseIII酶酶Dicer结结合，酶切合，酶切产生产生22nt双链双链RNA。e) 双链双链RNA中有中有一条单链一条单链miRNA与与RISC结合，结合，随后与靶随后与靶mRNA互作互作，打吧打吧mRNA。1）抑制）抑制Cap-40S翻译起始翻译起始 装置的组装；装置的组装；2）抑制抑制核糖体大亚基核糖体大亚基60S 组装组装成成核糖体核糖体；3）抑制翻译）抑制翻译延伸延伸；4）将）将核糖体核糖体驱逐驱逐脱离脱离翻译翻译 模板；模板；5）使翻译的）使翻译的新肽链降解新肽链降解；6）将）将mRNA拘

10、留在拘留在P-小体小体 中；中；7) 促使促使mRNA 降解降解；8) 切割切割mRNA;9) 介导介导染色质重排染色质重排抑制转抑制转 录。录。动物动物miRNAmiRNA基因属于基因属于PolIIPolII基因基因, ,加帽与加加帽与加尾尾, ,有三种分布方式有三种分布方式: :1)1)独立基因结构独立基因结构2)2)内含子中内含子中( (mirTronmirTron) )3)3)外显子中外显子中4)4)3UTR3UTR人类基因组约人类基因组约50% miRNA 基因成基因成簇状排列簇状排列。1/4人类人类miRNA位于位于内含子内含子中中.根据结构特征在人类基因组中已经注释的根据结构特征

11、在人类基因组中已经注释的miRNA基因基因为为328个个, 估计可能多于估计可能多于1000, 占占总总基因数基因数1%. 推测人类基因组中约推测人类基因组中约60%的基因的基因受受miRNA调控调控。 约约40%的的miRNA基因为基因为PolII转录转录.绝大多数绝大多数miRNA与靶标与靶标mRNA结合的位点在结合的位点在3UTR区区, 其中其中miRNA 的的5端端2-7nt最重要最重要， 5端端2-7nt为种子序列为种子序列。 1）研究发现，每个特异）研究发现，每个特异miRNA均可抑制多个靶均可抑制多个靶mRNA。在脊椎动物在脊椎动物miRNA 抑制效果表明，平均抑制效果表明，平均

12、每个每个miRNA可可抑制约抑制约400个保守的靶基因个保守的靶基因。2）实验证实，单个）实验证实，单个miRNA虽可抑制数百个不同蛋白质的虽可抑制数百个不同蛋白质的翻译，但就抑制效果而言，翻译，但就抑制效果而言，干扰程度微弱，处在温和水干扰程度微弱，处在温和水平，低于两倍数量平，低于两倍数量。因此，虽然因此，虽然miRNA是一种保守的起源古老而且分布广泛的是一种保守的起源古老而且分布广泛的转录后调控基因表达的方式，但只是在转录后调控基因表达的方式，但只是在精细调控上发挥精细调控上发挥作用作用。因而有人将其称之为是一种基因调控中的。因而有人将其称之为是一种基因调控中的“消震消震”措施。措施。

13、Genome Res. 19: 92105，2009植物植物miRNAmiRNA与动物与动物miRNAmiRNA的区别的区别: :1)1)成熟成熟miRNAmiRNA在在细胞细胞 核内完成核内完成. .2)2)植物植物miRNAmiRNA的两个的两个33 末端有末端有2nt2nt突出突出, ,被被 甲基化甲基化。防止被尿。防止被尿 嘧啶化，阻止降解。嘧啶化，阻止降解。3)3)植物植物miRNAmiRNA与与靶靶 mRNA mRNA互补程度高互补程度高, , 主要引起主要引起mRNA降降 解解. .a a）DICERDICER加工双链加工双链RNARNA产生产生 miRNAmiRNA。植物的植物

14、的DICERDICER称称 为为DCLDCL, ,有有4 4类（类（DCL1-DCL1- DCL4 DCL4），具），具dsRNAdsRNA内切内切 核酸酶活性。核酸酶活性。DCL1DCL1与与 miRNA miRNA加工有关加工有关。b) b) 植物植物miRNAmiRNA的的33端端有有两两 个碱基突出个碱基突出，甲基转移，甲基转移 酶酶HEN1HEN1在在miRNA 3miRNA 3端端 添加添加甲基甲基。c)c) miRNA miRNA 在在AGOAGO蛋白的协蛋白的协 助下打靶切割目标助下打靶切割目标mRNAmRNA Trends in Plant Science 15：337-34

15、5 ， 20101) 序列组成及靶标序列组成及靶标: 植物植物miRNA序列与靶序列与靶mRNA序序列互补程度高，导致列互补程度高，导致靶靶mRNA降解降解。动物动物miRNA序列与靶序列与靶mRNA序列互补程度略低序列互补程度略低, 抑制靶抑制靶mRNA翻译翻译。2) 作用位点作用位点: 动物动物中中miRNA的作用位置主要在靶的作用位置主要在靶mRNA的的3-UTR。 植物植物中中miRNA的作用位置可的作用位置可在靶在靶mRNA的的3-UTR, 但更多在但更多在编码区编码区.3) 3) 加工场所：加工场所：植物植物成熟成熟miRNAmiRNA在在细胞核细胞核内完成内完成, ,动物动物成熟成熟miRNAmiRNA在在细胞质细胞质内完成。内完成。4) 4) 植物植物miRNAmiRNA的两个的两个33末端末端-OH-OH被被甲基化甲基化。