单克隆抗体制备技术(共3页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上单克隆抗体制备技术 单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop)第一章: 小鼠免疫第二章: 细胞融合第三章: 细胞建株第四章: 细胞株鉴定第五章: 腹水制备第六章: 抗体纯化和鉴定(略)第一章. 小鼠免疫(BALB/c) 小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。一.小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:1.短程免疫方案: 第一次: 1d 100ug(可溶性Ag)+等体积完全佐剂. 腹腔注射. 0.4ml/只 第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂 腹腔注射. 0.4ml/只 第三次: 12d 50ug IV 0.

2、3ml/只(强化)第四次: 15d 20ug IV 0.3ml/只 第17 d24d内融合 2长程免疫方案: 第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂 腹腔注射(IP)0.4ml/只 第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂 IP 0.4ml/只 第三次: 21d 100ug IP或IV 0.4ml/只 第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只(强化)第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只第30d37d内融合.注 意:a.在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须1:8000,长程免疫1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后 所有小鼠需在一

3、周内做完融合. 否则不能保证融合质量。 二小鼠免疫质控标准1免疫鼠血清滴度 短程1：8000，长程1：32000；2小鼠免疫后需在一周内做完融合；3免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。免疫鼠选择：免疫种类为:balb/c小鼠；性别.雌性佳；大小：6-7周龄：体重：20g;健壮.活泼。第二章细胞融合一 融合前准备1 脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏，并制成单个脾细胞悬液，每只鼠的脾细胞约13亿。在制备过程中严格保证无菌。制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。2 SP2/0细胞准备：SP2/0细胞在融合前4天复苏.并用8- Ag筛选两次，隔天换液，在融合前一天换成

4、普通培养基1640,10%小牛血清，SP2/0细胞数量在2000万3500万为宜，细胞处于分裂期较佳，衰老细胞不宜使用。3 PEG1450准备：取PEG1450干粉高压后加入等体积 PBS在60溶解即可使用，一次融合取0.8ml 50% PEG1450.4 HAT培养基准备：根据铺板数量准备，20%小牛血清的HAT1640培养基.20ml/块板。5 终止液15-20ml:不含 Hepes的1640培养基或PBS(PH7.4)二. 融合:制备脾细胞悬液并用PBS(PH9.4)洗涤干净后混入SP2/0细胞按脾细胞比SP2/0=10:15:2混合并离心,1200rpmmin 离心后滴干混合细胞.轻敲

5、弹松细胞团块。在37水浴中加入PEG1450 0.8ml在50秒内加完不宜吹打，加完后在37水浴中反应2min后加入终止液在 5min内加完1520ml,加终止液时应沿管壁缓慢加入.动作应轻柔.不宜吹打以免使刚融合的细胞分离。三. 融合后加样:融合细胞终止后于900rpm8min离心，并吸干以防残留PEG。离心后把融合细胞转入HAT培养基，并滴板200ul/孔，全过程应防止吹散融合细胞。四. 换液:待融合细胞在HAT中培养7天左右后(即未融合的SP2/0和脾细胞死后)换成HT培养基。200ul/孔 第810天检测。第三章细胞建株一.融合板检测： 待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始

6、检测(检测方法参见附表ELISA方法)在ELISA质控合格(即阴性对照1.0)后挑选阳性孔(一般OD4500.5)作亚克隆。二.亚克隆方法及检测: 挑出融合板阳性孔全部细胞加入8-10ml HT培养基，混均铺板4-6纵行；待亚克隆生长5-7天，克隆长大(约1万个细胞以上/孔)，即可检测(用 ELISA方法)。三.单克隆铺板和检测: 挑取亚克隆检测阳性值高的孔计数作有限稀释4:2:1:0.5个细胞四个梯度铺板1个阳性细胞株/块。待单克隆生长7-10天，单克隆细胞长至中等大小 (1万/孔)时进行检测，其中单克隆细胞8个/株(一般检测12个孔)，待检测单克隆全阳后再进行一次同样的单克隆。四细胞株确立

7、： 待两次单克隆检测全阳后挑出三孔/株，作扩大培养于24孔板；24孔板细胞长满后作交叉Ag鉴定和稳定性鉴定(即再次测其培养上清看是否还能分泌单抗)鉴 定合格后选择其中一株长势好.OD450箱高的扩大培养于细胞瓶，并进行冻存，5支/株，200万/支细胞。第四章细胞株鉴定 在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定。鉴定标准：1.复苏活细胞数100万个细胞/支； 2.活细胞中有活力细胞50万/株; 3.复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细 菌.真菌.支原体等)出现. 4.复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计 数铺板.并检测单克隆的分泌抗体能力是否是否全阳或有抗

8、体分泌. 5.细胞培养上清也需作ELISA确定是否分泌抗体同时作交叉抗原复查,及 western-blotting鉴定是否为单抗。 第五章腹水制备及细胞株扩增腹水制备：在细胞株鉴定合格后收集培养瓶中细胞，打小鼠腹水方法如下：1. 小鼠选择：10周龄 baleb/c雌性小鼠，小鼠毛发油光，活泼约30克体重。2. 打腹水前小鼠准备：选优鼠在打腹水前，730天内致敏小鼠选石蜡油(或其它矿物油)0.5ml/只IP(腹腔)注射。3. 打腹水：收集合格杂交瘤细胞加于PBS(PH值7.4)或生理盐水(无菌)中,200万-500万/只鼠。IP4. 腹水收集：杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后5-7天即可产生腹水。(小鼠状态：腹部篷隆，小鼠精神萎靡，不思饮)此时可用无菌注射器抽取约2-5ml/只。腹水特点：血性或乳白色或微黄、脂性、略浓。一般隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次即可处死。)腹水保存：抽取腹水后置4过夜。离心500rpm10min.取上清短期存放于4(3-7天)，中期1-2月放于-20，长期6月者存放于-80。专心-专注-专业