药品质量控制中的现代分析方法与技术课件.ppt

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1、第二十一章第二十一章 药品质量控制中的药品质量控制中的现代分析方法的进展现代分析方法的进展 现代分析方法与技术，为药学的发展提供了现代分析方法与技术，为药学的发展提供了适时而有效的辅佐与动力。适时而有效的辅佐与动力。色谱及其联用技术：色谱及其联用技术： 药学研究分子水平。药学研究分子水平。手性分析：手性分析： 毛细管电泳及手性色谱技术药物研究毛细管电泳及手性色谱技术药物研究与质量控制提供了保障。与质量控制提供了保障。现代光谱技术：现代光谱技术： 药物结构鉴定，药物结构鉴定， 微量杂质检定。微量杂质检定。概况概况 一、定义一、定义 电泳电泳：带电物质在电场中向相反电极移动带电物质在电场中向相反电

2、极移动的现象称为电泳（的现象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis） 以此对物质进行分离分析的方法即以此对物质进行分离分析的方法即电泳法电泳法第一节第一节 毛细管电泳及其应用毛细管电泳及其应用 二、发展简史二、发展简史 电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄国年俄国物理学家物理学家ReRessss进行了世界上第一次电进行了世界上第一次电泳实验）。但毛细管电泳技术最早是由泳实验）。但毛细管电泳技术最早是由瑞典瑞典科科学家学家Hjerten Hjerten 提出的，其广泛应用，则是在提出的，其广泛应用，则是在193719

3、37年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。 国内最早是由国内最早是由竺安教授竺安教授在在19801980年提出来的，年提出来的，他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建立了两个研究组。立了两个研究组。19921992年年CECE开始受到国内广泛开始受到国内广泛重视，发展很快。重视，发展很快

4、。 三三. 毛细管电泳的优点毛细管电泳的优点1、高灵敏度、高灵敏度2、高分辨、高分辨3、速度快、速度快4、进样少、进样少5、成本低、成本低高灵敏度：紫外检测器的检高灵敏度：紫外检测器的检测极限在测极限在10-1310-15mol之间，之间，荧光检测可达荧光检测可达10-1910-21mol高分辨：峰分离效率超过高分辨：峰分离效率超过1百万理论百万理论塔板数，一般可达几十万塔板数，一般可达几十万。速度快：许多分析在几秒速度快：许多分析在几秒至至30分钟内完成。分钟内完成。进样少：一般需要毫微升的进样量。成本低：一般只需成本低：一般只需要可长期使用的毛要可长期使用的毛细管和极微量的可细管和极微量的

5、可自己配制的缓冲液。自己配制的缓冲液。分离模式：（一）毛细管区带电泳分离模式：（一）毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis ，CZE 带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度= =电泳和电渗流速度的矢量和。电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：正离子：两种效应的运动方向一致，在两种效应的运动方向一致，在负极最先流出负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；出； 阴离子阴离子：两种效应的运动方向：两种效应的运动方向相反；相反；电渗流电渗流 电泳电泳, ,阴离子在阴离子在负负极最后流出极最后流出

6、, ,在这种情况下在这种情况下, ,不但可不但可以按类分离以按类分离, ,同种类离子由于差速同种类离子由于差速迁移被相互分离。迁移被相互分离。 最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；1.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。负电的胶束。（二）胶束电动毛细管色谱（二）胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 在电场力的在电场力的作用下，胶束在作用下，胶

7、束在柱中移动。柱中移动。 2. 2. 电泳流和电渗流的方向相反，电泳流和电渗流的方向相反， 且且电渗流电渗流 电泳电泳 ，负电胶束以较慢的速度，负电胶束以较慢的速度向负极移动；向负极移动； 5. 5.色谱与电泳分离模式的结合。色谱与电泳分离模式的结合。 3. 3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 4.4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；泳的应用范围； （三）毛细管凝胶电泳（三）毛细管凝胶电泳 （capill

8、ary gel electrophoresis,CGE) （四）毛细管等速电泳（四）毛细管等速电泳 （capillary isotachor-phoresis,CITP) （五）毛细管等电聚焦电泳（五）毛细管等电聚焦电泳 （capillary isoelectric focusing,CIEF) （六）毛细管电色谱（六）毛细管电色谱（ capillary electrochromatography,CEC) （七）微芯片毛细管电泳（七）微芯片毛细管电泳 （microchip electrophoresis)应用与进展应用与进展 毛细管电泳技术可检测多种样品，如血毛细管电泳技术可检测多种样品，如

9、血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸多种组分，如核酸/ /核苷酸、蛋白质核苷酸、蛋白质/ /多肽多肽/ /氨氨基酸、糖类基酸、糖类/ /糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNADNA序列分析和序列分析和DNADNA合成中产物纯度测定等合成中产物纯度测定等 1 1、离子分析、离子分析 analysis of ion阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗迁移方向和电渗流方

10、向一致；流方向一致； 4.5min4.5min内分离了内分离了2424种金属离子；种金属离子； 阳极进样，阴极阳极进样，阴极检测；检测； 具有很高的灵敏具有很高的灵敏度；度；2 2、药物分析、药物分析 analysis of pharmaceutics检测体液或细胞检测体液或细胞中某些代谢产物的分中某些代谢产物的分析；析； 尿液中的氨基酸尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；尿病的辅助手段； 采用毛细管区带采用毛细管区带电泳方式，在电泳方式，在11min11min内分离内分离1717种药物；种药物；采用采用MEKCMEKC模模式，鉴定违式，鉴定违禁药物；效禁药物；效

11、果优于果优于HPLGHPLG法法3 3、手性化合物分析、手性化合物分析 analysis of chiral compounds HPCEHPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；选择剂； 形成配合物的稳定常数有差异，结合形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCEHPCE的的高效率；高效率； 常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）活性剂）4

12、 4、氨基酸与蛋白质分析、氨基酸与蛋白质分析 analysis of amino acids 采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在2525分钟内分离了分钟内分离了2323种丹酰化氨种丹酰化氨基酸；基酸；HPCEHPCE可取代传统的氨基酸分析仪；可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；问题：吸附和检测；蛋白质分析蛋白质分析5 5、核酸分析及、核酸分析及DNADNA排序排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA重要分析手段；重要分析手段；酶解的双螺旋酶解的双螺旋DNADNA限制性片段限制性片段的分离；的分离；CE和和HGP 目前，目前，

13、人类基因测序人类基因测序已已基本完成，人类基因基本完成，人类基因组计划进入后基因组时代组计划进入后基因组时代。但是但是，耗资巨大的，耗资巨大的HGP至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影响力。这是因为响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的所有基因的“身份身份”以及它们所编码的蛋白质。以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的构筑生命大厦的“砖块砖块”角色，其中可能藏着开角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的发疾病诊断方法和新药的“钥

14、匙钥匙”。“后基因时后基因时代代”，一个以，一个以“蛋白质组蛋白质组”为重点的生命科学的为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。电泳技术将发挥更大的作用。蛋白质蛋白质肽片段混合物肽片段混合物酶切酶切CZE分离分离特征性肽图微量制备微量制备CE分别测定各片段的氨基酸序列整个蛋白质整个蛋白质的一级结构的一级结构CECE应用举例应用举例-肽的分析肽的分析6 6、新进展、新进展advances and special topics1 1）微型化）微型化 整体化学分析系统（整体化学分析系统（TASTAS）及）及TAS

15、TAS微型化微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数10105 5/m/m；2 2）联用仪器）联用仪器 CE-MS CE-MS；3 3）阵列毛细管凝胶电泳）阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因应用于人类基因DNADNA测序；测序； 5 51010万个基因，万个基因，3030亿个碱基对，目前最有效的亿个碱基对，目前最有效的DNADNA序列分析仪，序列分析仪，1010小时小时/ /次；可同时电泳次；可同时电泳2424个样品；速度个样品；速度12001200碱基对碱基对/ /小时，提高速度！小时，提高速度！100100支毛细管阵列电泳；速度支毛细管阵

16、列电泳；速度280280碱基对碱基对/ /小时小时/ /支支第二节第二节 超高效液相色谱及其应用超高效液相色谱及其应用UPLC超高效液相色谱的发展超高效液相色谱的发展 站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，

17、也提出了更高的要求。与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。 因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新认识。由此，认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。的极限作为自己的起点。 超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以下几个方面的进步：以下几个方面的进步：（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现；）小颗粒、高性能微粒固定相的出

18、现；（2）超高压输液泵的使用；）超高压输液泵的使用；（3）高速采样速度的灵敏检测器；）高速采样速度的灵敏检测器； （4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术配备了针内进样探头和压力辅助进样技术 （5）仪器整体系统优化设计：色谱工作）仪器整体系统优化设计：色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。析方法与高效液相分析方法的自动转换。分析速度快分析速度快灵敏度高灵敏度高分离度好分离度好超高效液超高效液相色谱的相色谱的优点优点0.000.040.080.

19、120.160.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.001. Thiourea - 0.4302. toluene - 1.0343. propylbenzene - 1.7424. butylbenzene - 2.4135. hexylbenzene - 5.058 样品的组份数：样品的组份数：55m颗粒度颗粒度完全分离时间：完全分离时间：6.00分钟分钟0.200.241. Thiourea - 0.0462. toluene - 0.0883. propylbenzene - 0.1374. butylbenzene - 0.

20、1825. hexylbenzene - 0.360UPLCAU0.000.100.20Minutes0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60UPLCHPLC样品的组份数：样品的组份数：51.7m颗粒度颗粒度完全分离的时间：完全分离的时间：0.60分钟分钟UPLCUPLC的速度提高了！的速度提高了！增加了样增加了样品的通量品的通量0.00AU使用使用1.7m1.7m颗粒度的填颗粒度的填料增加灵敏度料增加灵敏度可看到更多可看到更多的样品信息的样品信息AU0.0000.0040.0080.0120.0160.020Minutes1.701.8

21、01.902.002.102.202.302.402.502.601.7 mAU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00AU0.0000.0100.0200.0300.0400.0505.0 m0.024恒定柱长时；恒定柱长时；UPLCUPLC的灵敏度提高的灵敏度提高1.71.7倍（倍（170%170%）！）！恒定恒定L/dpL/dp时；时；UPLCUPLC的灵敏度提高三倍（的灵敏度提高三倍（300%300%）！）！Ultra Performance LC 速度、灵敏度与分离度的结合速度、

22、灵敏度与分离度的结合AU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.00AU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0015.005.0 m1.7 m60% 更快更快30% 更灵敏更灵敏70% 更高分离度更高分离度在改进获得信息质量的前提下提高分析速度在改进获得信息质量的前提下提高分析速度Ultra Performance LC 速度、灵敏度与分离度的结合速度、灵敏度与分离度的结合AU-0.0020.0000.002

23、0.0040.0060.0080.0100.012Minutes0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00AU-0.0020.0000.0020.0040.0060.0080.0100.012Minutes0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00HPLC3.5mUPLC1.7m对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度生产力：每次实验得到更多信息生产力：每次实验得到更多信息AUAU2.理论基础理论基础 在高效液相色谱速率理论中，在高效液相色谱速

24、率理论中， Van Deemter方程式的简化表达式：方程式的简化表达式： 如果仅考虑固定相的粒度如果仅考虑固定相的粒度 对对 的影响，其的影响，其简化方程式可表达为：简化方程式可表达为：van Deemter 曲线带来的承诺曲线带来的承诺如果填料的颗粒继续演变如果填料的颗粒继续演变更小的颗粒度更小的颗粒度填料颗粒尺寸的演变填料颗粒尺寸的演变前景：前景：2.1100mm色谱柱1.7m杂化填料颗粒可达到15,000psi通常有每米200,000理论塔板数的柱效速度、灵敏度及速度、灵敏度及分离度的完美结合分离度的完美结合Minutes1.000.000.200.400.600.80AU0.0000

25、.0200.040一分钟以内！一分钟以内！3.UPLC仪器介绍仪器介绍检测器：检测器： 光学及光学及/或质谱检测器或质谱检测器 可调紫外或光电二极管可调紫外或光电二极管矩阵；矩阵； 为为UPLC专门专门优化的流动池；优化的流动池； 高速检高速检测测色谱柱管理：色谱柱管理： 创新的枢轴转动设计创新的枢轴转动设计 置色谱柱出口直接到检测器置色谱柱出口直接到检测器样品管理器：样品管理器： 低扩散低扩散XYZZ形式形式 快速进样周期快速进样周期 低交叉污染低交叉污染 样品盘及样品盘及/或样品瓶或样品瓶 可选样品组织器可选样品组织器两元溶剂管理：两元溶剂管理： 高压混合高压混合 两元梯度两元梯度 四溶剂

26、选择四溶剂选择 在线脱气在线脱气 低扩散设计低扩散设计 UPLC的耐压能力的耐压能力3.1 超高效液相色谱的超高效液相色谱的C18色谱柱色谱柱dpn固定相粒度固定相粒度直径可达直径可达1.7mn色谱柱长可色谱柱长可达达3-5cm3.1.1 色谱柱颗粒化学色谱柱颗粒化学在杂化的碳在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的硅基质内具有桥式乙烷的1.7m颗粒颗粒三官能团键合三官能团键合C18配体配体改善了高改善了高pH稳定性稳定性改善了硅胶的柱效和反压改善了硅胶的柱效和反压改善了低改善了低pH稳定性稳定性3.1.2 色谱柱硬件色谱柱硬件筛板、柱管和连筛板、柱管和连接件，可在超过接件，可在超过140MPa压力

27、下压力下装填，保证色谱装填，保证色谱柱高柱效和长寿柱高柱效和长寿命。命。 n 可记录进样次数、最大反可记录进样次数、最大反压及温度压及温度n智能芯片自动下载关键参智能芯片自动下载关键参数到色谱柱历史文件数到色谱柱历史文件n信息不可删除信息不可删除n含有该色谱柱独特的分析含有该色谱柱独特的分析证书证书eCord 装置装置3.2 超高效液相色谱的输液系统超高效液相色谱的输液系统3.2.1 3.2.1 二元溶剂管理系统二元溶剂管理系统n高压混合高压混合n二元梯度二元梯度n四溶剂选择四溶剂选择n在线脱气在线脱气n低扩散设计低扩散设计n耐高压耐高压3.2.2 UPLC超高压输液泵的特性超高压输液泵的特性

28、与普通与普通HPLC的高压梯度的高压梯度系统相比，系统相比，UPLC的梯度的梯度性能极佳性能极佳当梯度陡度为当梯度陡度为1%1%，梯度范围为，梯度范围为90%-100%90%-100%时，超高压输液时，超高压输液泵的梯度运行曲线泵的梯度运行曲线 UPLC的重现性的重现性UPLC 34次进样分析烷基芳酮混合物保留时间的重现性次进样分析烷基芳酮混合物保留时间的重现性其精确度、其精确度、可靠的梯可靠的梯度性能与度性能与HPLC的的重现性不重现性不相上下相上下UPLC的耐受性的耐受性稳定性试验的条件：稳定性试验的条件：从从10到到90%甲醇的甲醇的1分钟梯度分钟梯度1000次进样次进样温度：温度：55

29、C最大压力：最大压力：8500psi流速：流速：1.3ml/min.AU0.000.050.100.150.200.250.300.35Minutes0.000.250.500.751.001.251.501.75ACQUITY UPLC C18 色谱柱2.130mm 1.7m黑色：第一次进样红色：第1000次进样3.3 超高效液相色谱的高速检测器超高效液相色谱的高速检测器UPLC光导检测器流通池示意图光导检测器流通池示意图采样速度快采样速度快能减少谱带扩展能减少谱带扩展以保持柱效以保持柱效灵敏度比灵敏度比HPLC提提高高2-3倍倍流通池体积小、池壁全折射而不损失光能量流通池体积小、池壁全折射

30、而不损失光能量3.4超高效液相色谱的自动进样器超高效液相色谱的自动进样器 针内针装置外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到微量取样（达到微量取样（L取样）取样）n减少死体减少死体积，降低谱积，降低谱带扩展带扩展n快速自动快速自动取样取样n低扩散、低扩散、低交叉污染低交叉污染4.1 超高效液相色谱的应用超高效液相色谱的应用 药物分析药物分析 如天然产物中复杂组分的分析如天然产物中复杂组分的分析 生化分析生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品 食品分析食品分析 如食品中农药残留的检测如食品中农药残留的检测

31、 环境分析环境分析 如水中微囊藻毒素的检测如水中微囊藻毒素的检测 其他其他 如化妆品中违禁品的检测如化妆品中违禁品的检测 高分辨串联质谱高分辨串联质谱QTOF micro 灵敏度高灵敏度高(pg-fg级级)和选和选择性强得到的质谱谱图择性强得到的质谱谱图数据完整、品质高。因数据完整、品质高。因而，在天然产物，新药而，在天然产物，新药开发，药代研究和蛋白开发，药代研究和蛋白质组学领域的定性、定质组学领域的定性、定量分析研究方面占有重量分析研究方面占有重要地位。要地位。 从从HPLC-MS到到UPLC-MS 灵敏度明显提高灵敏度明显提高Ultra Performance LC 先进的MS入口技术

32、代谢物IDHPLCUPLC4.2 超高效液相色谱的展望超高效液相色谱的展望 UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，为用户的工作，为用户节省节省宝贵的宝贵的时间时间和日常和日常溶剂溶剂消耗，从消耗，从而获得最大的投资回报。而获得最大的投资回报。 UPLC的高分离度可从容面对的高分离度可从容面对复杂组份复杂组份（如蛋白质与（如蛋白质与代谢组学等生化领域、天然产物）分离的挑战。代谢组学等生化领域、天然产物）分离的挑战。 UPLC的高灵敏度可检测更加的高灵敏度可检测更加痕量痕量的目标化合物。的目标化合物。 UPLC的快速分析大量样品，实现的快速分析

33、大量样品，实现高通量高通量。第三节第三节 手性高效液相色谱技术与应用手性高效液相色谱技术与应用 一一 手性药物拆分机理手性药物拆分机理 为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是行的是“三点手性识别模式三点手性识别模式”。Thalidomide Event 美

34、国食品与药品管理局（美国食品与药品管理局（FDA）在）在1992年颁布了手性药物指导原则，要求所有在美年颁布了手性药物指导原则，要求所有在美国上市的外消旋新药，其生产者均需说明药国上市的外消旋新药，其生产者均需说明药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果。临床效果。 手性药物对映体的药效学差异手性药物对映体的药效学差异1. 1. 治疗作用完全依赖一种异构体治疗作用完全依赖一种异构体 如：如：S S(-)-(-)-甲基多巴甲基多巴2. 2. 药理作用差别不大药理作用差别不大 如：异丙嗪如：异丙嗪3. 3. 药理作用类似，但反应强度有差别药理作用类似，

35、但反应强度有差别4. 4. 药理与毒理作用存在药理与毒理作用存在“质质”的区别的区别 手性药物对映体的药动学差异手性药物对映体的药动学差异 1.1.吸收吸收 2.2.蛋白结合蛋白结合 3.3.代谢代谢 手性药物的现状手性药物的现状手性药物手性药物（579579）药物药物（19921992）天然和半天然和半合成药物合成药物（556556）合成药物合成药物（14361436）非手性药物非手性药物（857857）单一异构体单一异构体（7373）外消旋体外消旋体（506506）手性药物手性药物（547547）非手性药物非手性药物（9 9）单一异构体单一异构体（537537）外消旋体外消旋体 （1010

36、）Worldwide sales of chiral drugs350452614812133070693411800300600900120015001993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000100 million $ Increasing 8% per year $200 billion 2008 (projected)2004年全世界销售总额名列前年全世界销售总额名列前20的药物的药物公司商品名药品名手性专利完了(美国)销售额(全世界)美国$MMPfizerPfizerLipitorLipitoratorvastatin Caatorvastatin

37、Ca单单一一对对映 体映 体10,86210,862MerckMerckZocorZocorsimvastatinsimvastatin单单一一对对映 体映 体200520055,1975,197GSKGSKSeretide/AdvairSeretide/Advairsalmeterol/fluticasonesalmeterol/fluticasone单单一一对对映 体映 体200320034,5044,504PfizerNorvascamlodipiner20074,463LillyZyprexaolanzapineN4,420AstraZenecaAstraZenecaNexiumNex

38、iumesomeprazoleesomeprazole单单一一对对映 体映 体3,8833,883TakedaTakepron/Prevacidlansoprasolr20053,454BMS/SankyoBMS/SankyoPravachorPravachorpravastatinpravastatin单单一一对对映 体映 体200620063,3983,398PfizerPfizerZoloftZoloftsertralinesertraline单单一一对对映 体映 体3,3613,361WyethEffexor XRvenlafaxiner20073,347BMSBMSPlavixPla

39、vixclopidogrelclopidogrel单单一一对对映 体映 体200320033,3273,327PfizerCelebrexcelecoxibN3,302PfizerNeurontingabapentinN20042,723Sanofi-AventisSanofi-AventisLovenox/ClexaneLovenox/Clexaneenoxaparin Naenoxaparin Na单单一一对对映 体映 体200420042,3662,366Sanofi-AventisSanofi-AventisPlavixPlavixclopidogrelclopidogrel单单一一对

40、对映 体映 体200320032,1052,105GSKAvandiarosiglitazoner2,042AstraZenecaSeroquelquetiapineN2,027AstraZenecaLosec/Prilosecomeprazoler20021,947GSKGSKPaxil/SeroxatPaxil/Seroxatparoxetineparoxetine单单一一对对映 体映 体200320031,9451,945Sanofi-AventisAllegra/Telfastfexofenadine HClr20021,866 r:racemic; N:achiral手性药物对映体分

41、离的方法手性药物对映体分离的方法（1） 生物转化不对称催化法生物转化不对称催化法（2）液）液-液萃取法液萃取法（3）传感器法）传感器法（4）渗透膜法）渗透膜法（5）重结晶法）重结晶法（6）色谱法：手性衍生化法（）色谱法：手性衍生化法（CDR） 手性流动相添加剂法（手性流动相添加剂法（CMPA） 手性固定相法（手性固定相法（CSP） 1 1柱前手性衍生化法：对映体混合物以手柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。常规（偶见手性）固定相分离。 对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。对手性衍生化试剂的

42、要求：高光学纯度。 常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。 2.2.手性流动相拆分法（手性洗脱法或手手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂环糊精类添加剂

43、、手性离子对络合剂 3. 3.手性固定相拆分法：将手性选择剂固着手性固定相拆分法：将手性选择剂固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。的分子结构来选择合适的手性柱。常用的手性固定相常用的手性固定相：PirklePirkle型手性固定相、蛋型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。 给体给体受体受体:如如Pirkle型型CSP， 纤维素衍生物类纤维素衍生物类: CDMPC 主客体络合主客体络合:

44、 如环糊精、冠醚类如环糊精、冠醚类CSP 手性配体交换色谱手性配体交换色谱 蛋白质类蛋白质类 HNOCH3CH3NO2NO2SiO(S, S)-Whelk-O-1(R, R)-DNB-DPEDAO2NNO2NHONHOSiH3CCH3OC6H5C6H5PirklePirkle型型CSPCSP手性手性识别机理：识别机理：“三点作用模式三点作用模式”chiral target or chiral stationary phasechiral target or chiral stationary phasechiral target or chiral stationary phase纤维素衍生物

45、类纤维素衍生物类CSP CSP 纤维素是纤维素是D(+)-D(+)-葡萄糖单元由葡萄糖单元由1,4-1,4-糖苷键形成的高度有糖苷键形成的高度有序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分子序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分子 纤维素三（纤维素三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC, Chiracel ODCDMPC, Chiracel OD） Okamoto：510（62%） CH3CH3CH3CH3CH3CH3OCONHOCONHOCONHOOn几种常见的纤维素衍生物几种常见的纤维素衍生物 （三）应用（三）应用1 1对某些手性药物进行对映体的纯度检查；对某些手性

46、药物进行对映体的纯度检查；2 2生物体液中药物对映体的分离分析研究可探生物体液中药物对映体的分离分析研究可探 索血药浓度与临床疗效的关系；索血药浓度与临床疗效的关系；3 3在研制手性药物过程中，可分别评价单个对在研制手性药物过程中，可分别评价单个对 映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；4 4必要时，可进行手性药物对映体的制备分离必要时，可进行手性药物对映体的制备分离 （或拆分）。（或拆分）。 示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）性衍生化法）手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯手性衍生化试剂：乙酰

47、葡萄糖异硫氰酸酯色谱条件：色谱条件：色谱柱色谱柱NOVA-Pack CNOVA-Pack C1818（150mm150mm3.9mm3.9mm）流动相：甲醇流动相：甲醇-0.01mol/L-0.01mol/L磷酸二氢钾磷酸二氢钾 （pH2.8pH2.8）（）（51495149） 该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。分析。示例二、示例二、DL-DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）色氨酸的拆分

48、（手性流动相拆分法）色谱条件：色谱条件：色谱柱：色谱柱：Zorbax ODSZorbax ODS（250mm250mm4.6mm4.6mm），），流动相：含有流动相：含有0.15%L-0.15%L-苯丙氨酸及苯丙氨酸及0.11%0.11%硫酸铜硫酸铜（CuSOCuSO4 45H5H2 2O O）水溶液（以）水溶液（以0.05mol/L0.05mol/L硫酸调硫酸调pHpH至至3.03.0）- -甲醇（甲醇（9191）（流动相中）（流动相中L-L-苯丙氨酸苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为及硫酸铜浓度分别为0.008mol/L0.008mol/L和和0.004mol/L0.004mol/L）。）。 流动

49、相中流动相中L-L-苯丙氨酸为配基交换型手性添苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子，加剂，硫酸铜为二价金属螯离子，L-L-苯丙氨酸苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。柱上拆分。示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）拆分法）色谱条件：色谱条件：色谱柱色谱柱 Chirex 3005 Chirex 3005手性色谱柱手性色谱柱 （R R）-1-1-萘基甘氨酸和萘基甘氨酸和3 3，5-5-二硝基

50、二硝基 苯甲酸以共价键结合苯甲酸以共价键结合 流动相流动相 正己烷正己烷- -二氯乙烷二氯乙烷- -甲醇甲醇该法的拆分机理为该法的拆分机理为“三点手性识别模式三点手性识别模式”。 甲硫氨酸甲硫氨酸 对羟基苯甘氨酸对羟基苯甘氨酸TE CSPTE CSPMP-TE CSPMP-TE CSPPCl-TE CSPPCl-TECSP 第四节第四节 GC-MSGC-MS和和LC-MSLC-MS 技术与应用技术与应用n 色谱质谱的在线联用色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样