抑癌基因p27编码蛋白与细胞周期蛋白d1在疣状胃炎及胃癌组织中表达及意义.pdf

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1、顾湘：抑癌基因p27编码蛋白与细胞周期蛋白DI在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义 1抑癌基因p27编码蛋白与细胞周期蛋白D1在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义研究生：顾湘导师：朱海杭教授中文摘要目的：疣状胃炎是一种具有特殊形态的慢性胃炎，其病因及发病机制尚未明确，病理学上存在一定比例的肠上皮化生和异型增生。研究提示疣状胃炎与胃癌可能存在相关性，但是疣状胃炎的癌变的分子机制尚不清楚。关于疣状胃炎的癌相关基因的研究报道较少，我们通过分析疣状胃炎的病理表现、检测p27蛋白及细胞周期蛋白cyclinDl在浅表性胃炎组织、疣状胃炎组织及胃癌组织中的表达，探讨疣状胃炎、胃癌之间的关系及其可能存在的癌变的分

2、子机制，为疣状胃炎及胃癌的预防与治疗提供更多的依据。方法：收集2012年1月2012年12月扬州大学临床医学院胃镜室及手术室符合研究要求的标本，包括慢性浅表性胃炎、未成熟型疣状胃炎、成熟型疣状胃炎、胃癌组织各40例。标本HE染色，显微镜下分析慢性浅表性胃炎及不同分型疣状胃炎的病理表现。采用免疫组织化学二步法检测组织标本中p27蛋白、cyclin D1的表达。Hp感染情况采用快速尿素酶法检测。数据统计采用SPSS 160及Excel2003软件。结果：1、未成熟型疣状胃炎、成熟型疣状胃炎两组肠上皮化生率(275、300)均高于慢性浅表性胃炎组(75)(尸005)；成熟型疣状胃炎组低于慢性浅表性胃

3、炎组及未成熟型疣状胃炎组(P005)。组(333)(PO05)。结论：关巍。翩瑶白 Y241988帆7唧疣状胃炎；胃癌；病理；p27蛋白；cyclin D1Expression ot tumor suppressor gene p2encoding protein and一 一一 o 1cyclin D 1 in varioliform gastritis and gastric cancerObj ectiveMSCandidate：Gu XiangSupervisor：ProfZhu HaihangAB STRACTVarioliform gastritis iS a special ty

4、pe with a characteristic form of chronic gastritis。itSetiology and pathogenesis is not clearIn pathological category,there is a certain percentage ofvarioliform gastritis show intestinal metaplasia and dysplasia。Some studies have prompted thatthere may be a close relationship between varioliform gas

5、tritis and the development of gastriccancer,the molecular mechanism of carcinogenesis iS not clearThere iS only a feW studies aboutcancer-related genes of varioliform gastritis，we study the expression of p2protein and cyclinD l in varioliform gastritis and gastric carcinoma to investigate the relati

6、onship betweenvarioliforlTl gastritis and gastric cancer,to discuss its possible molecular mechanism ofcarcinogenesisand provide more evidence for the prevention and treatment of variolifornlgastritis and gastric cancerMethodsCollect Tissue samples met the research requirements in the gastroscope Ce

7、nter andoperating room form January 2012 to December 2012include 40 cases of chronic superficialgastritis，40 cases of immature varioliform gastritis，40 cases of mature varioliform gastritis，40cases of gastric carcinomaUse the HE staining，analysis the pathologicalmanife-stations ofchronic superficial

8、 gastritis and different type of varioliforill gastritis by the microscopeTheimmunohistochemistry 2-step detection system was used to detect the expression of p27 proteinand cyclin D 1Urea enzyme method was used to detect the infection of Hprnle data wasanalysed by SPSS 160 and Excel 2003Result1The

9、rate of intestinal metaplasia of Immature varioliform gastritismature verrucosagastritis(275，30O)were higher than chronic superficial gastritis(75)(尸005)2The positive rates of p27 protein expression in chronic superficial gastritisimmaturevariolilbrm gastritis，mature verrucosa gastritis，gastritis ve

10、rrucosa(total)，gastric cancer were850，775，525，65O，45OThe positive rate of p27 protein expression in immaturevariolifonn gastritis was higher than mature verrucosa gastritis and gastric cancer fPO05)The positive rate of p27 expression in mature verrucosa gastritiswas lower than chronic superficial ga

11、stritis and immature verrucosa gastritiswhile there WaS no扬州人学硕士学位论文 4significant difference between mature verrucosa gastritis and gastric cancer(YO05)3The positive rates of cyclin D 1 expression in chronic superficial gastritis，immaturevarioliforrn gastritis，mature verrucosa gastritis，gastritis ve

12、rrucosa(total)，gastric cancer were125，400，425，4125，675The positive rate of cyclin D1 expression in immaturevarioliform gastritis and mature verrucosa gastritis were higher than chronic superficial gastritis(P005)5The Hp infection rates in chronic superficial gastritisimmature V撕oliform gastritismatu

13、re verrucosa gastritis group were 12。5，350，and 400The positive rate ofp27 proteinexpression in Hp positive varioliform gastritis(600)had no difference with Hp negativevarioliform gastritis(68O)and the positive rate of cyclin D1 expression(533，340)wasthe same result(P005)6The positive rate of p27 pro

14、tein expression in intestinal metaplasia positive varioliforrngastritis group(43。5)was lower than the intestinal metaplasia negative group(736)p005)ConclusionsVarioliform gastritis have the potential of cancerization，and mature varioliform gastritis aremore likely to have carcinomatous changep27 and

15、 cyclin D 1 may be involved in the process ofthe occurrence，evolution and cancerization of varioliform gastritisVarioliform gastritis patientsshould have active treatment and close followup，especially for those patients with intestinalmetaplasia or dysplasiaKev wordsvarioliform gastritis；gastric can

16、cer；Pathology；p27；cyclin D1顾湘：抑癌基冈p27编码蛋白与细胞周期蛋白Dl在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义 5目录中文摘要1英文摘要3符号说明6前言8第一部分疣状胃炎的病理分析101材料和方法102 结果1221炎症程度1222萎缩、肠上皮化生及异型增生133讨论15第二部分p27蛋白、cyclin D1在疣状胃炎及胃癌组织中的表达研究171材料和方法172结果1921 p27蛋白的表达1922 cyclin D1的表达2223疣状胃炎患者年龄、性别与p27蛋白、cyclin D1表达的相关性2524疣状胃炎组中Hp感染与p27蛋白、cyclinDl表达的相关性25

17、25疣状胃炎组中肠上皮化生与p27蛋白、cyclin D1表达的相关性：2626疣状胃炎组中异型增生与p27蛋白、cyclinDl表达的相关性2727疣状胃炎及胃癌中p27蛋白、cyclinDl表达的相关性分析303讨论-30结论33参考文献34综述38致i勇45攻读学位期间完成的论文46扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书47扬少I1大学硕士学位论文缩写VGHpcyclinCDKCDKICAKPEBPTXNDCCipKipSerLeuCvsThrRbDNAHEHRPDABH202PBSNaClNaH2P04符号说明英文全称varioliform gastritisHelicobacte

18、r pyloricyclincyclin dependent kinasescyclin dependent kinase inhibitorscyclin dependent ldnases-activatingkinasephosphatidylethanolaminebinding proteinthioredoxin domaincontaining proteincyclin dependent kinases interactingproteincyclin dependent kinase inhibitionproteinserineleucinecysteinethreoni

19、neretinoblastomadeoxyribonuclieic acidhematoxylin and eosinhorseradish peroxidasediaminobenzidineperoxidephosphate buffered salinesodium chloridesodium phosphate monobasic中文全称疣状胃炎幽门螺杆菌细胞周期蛋白细胞周期蛋白依赖激酶细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂细胞周期蛋白依赖激酶激活性激酶磷l眦Jljl厶+1。：1合蛋白硫氧还蛋白域蛋白细胞周期蛋白依赖激酶影响蛋白细胞周期蛋白激酶抑制蛋白丝氨酸亮氨酸半胱氨酸苏氨酸视蛋白网膜母细胞瘤

20、脱氧核糖核酸苏木精伊红辣根过氧化物酶二氨基联苯胺过氧化氢磷酸盐缓冲液氯化钠磷酸二氢钠顾湘：抑癌基因p27编码蛋白与细胞周期蛋白D1在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义 7Na2HP04SPSSP，rVSUmmlLmggSmlnhdisodium hydrogen phosphateStatistical package for the social sciencepropabilitycorrelationchisquareVersUScemidegreemicrometermilliterlitermilligramgralTlsecondminutehour磷酸氢二钠社会科学统计套装软体概率

21、相关系数卡方比摄氏度微米毫升升毫克克秒分钟小时扬州大学硕士学位论文日|J吾疣状胃炎(varioliform gastritis，VG)是一种具有特殊形态的慢性胃炎，又称慢性糜烂性胃炎、痘疹状胃炎，国内外疣状胃炎的发病率报道不一，其病因及发病机制尚未明确。疣状胃炎的临床表现缺乏特异性，Hp的感染率较高，内镜特征与普通的慢性胃炎存在明显区别。疣状胃炎典型的内镜表现为胃黏膜局部隆起伴中央脐样凹陷，凹陷表面常有糜烂，隆起性病变。般为多发性，呈圆形、椭圆形或不规则形，直径510mm，隆起高度1-3ram，呈簇状或链状出现在胃窦部，也可出现在胃体及胃底部。疣状胃炎在病理学上存在一定比例的肠上皮化生和异型增

22、生。有研究提示疣状胃炎和胃癌的存在密切关系，并有临床研究观察到疣状胃炎可发生癌变。在第十届世界胃肠病大会上，疣状胃炎被列为有高度癌变倾向的疾病Il J。但疣状胃炎的癌变的分子机制尚不清楚，国内外关于疣状胃炎的分子生物学研究非常有限，针对癌相关基因改变的研究报道则更少。有研究提示疣状胃炎具有癌变的倾向，而胃癌的发病率位居世界第四位，病死率位居世界第二位。每年被诊断为胃癌的患者大约有798万人，约占总的癌症病例的990；每年约有628万人死于这种疾病，占癌症死亡人数的121。在东亚国家，包括中国，胃癌的发病率和死亡率在各种癌症中排名第一，并在过去的二十年中迅速增长。胃癌的发生是一个多因素、多步骤的

23、复杂逐步发展过程，癌基因的激活或突变、抑癌基因的失活或抑制、DNA微卫星的失稳及生长因子的表达失调可打破胃上皮细胞的增殖及凋亡平衡，参与癌变的过程。但是胃癌的癌变过程并没有完全明白，其发生及发展机制并不十分清楚【2J。p27基因是一种抑癌基因，定位于人体12号染色体12p13处，含有2个外显子及2个内含子【3l。其表达产物p27蛋白是种细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclin dependentkinase inhibitors CDKI)，含198个氨基酸残基，相对分子量约27000，C端包含核定位信号，为分开的氨基酸双支，N端的晶体结构为其功能区域，由69个氨基酸组成，含有两个Ser磷酸化

24、位点41。细胞周期蛋白D(cyclin D)为一种重要的细胞周期调节因子，包括三个亚型，cyclinD1、cyclin D2和cyclin D3，其中以cyclin D1的研究较多，与肿瘤的关系较为明确【51。cyclinD1编码基因定位于人染色体llql3，含有4个内含子和5个外显子。cyclin D1是一种核内调控蛋白，含有295个氨基酸，相对分子量约36000，N端含有一特殊序列LeuXcysXE，能与的C端结合，而cyclin D1的C端与蛋白降解密切相关，富含有Thr、Ser等氨基酸残基6】。p27蛋白与cyclin D1均为细胞周期调控因子，与肿瘤的发生发展密切相关。细胞周期顾湘：

25、抑癌基因p27编码蛋白与细胞周期蛋白D1在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义 9分为G0G1期、S期、G2期和M期，通过细胞周期蛋白(cyclin)，细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinases，CDK)和CDKI调控。cyclin与CDK结合成cyclin-cDK复合物，通过调节CDK亚单位的磷酸激酶活性以发挥作用。而CDKI可竞争性的结合CDK以抑制其活性，达到对细胞周期的调控作用。有丝分裂信号诱导静止期细胞从GO期进入G1期使cyclin D增加，并合成CDK4和CDK6复合物进入细胞核。活化的cyclin DCDK46复合物出现在G1中期，其活化是通过CDK激活

26、性激酶(cdkactivating kinase，CAK)使特殊的Thr残基磷酸化实现的。Gl后期，cyclin E水平增加，合成cyclin ECDK2复合物，亦是通过CAK活化。CDK46和CDK2使Rb家族成员磷酸化从而释放被抑制的转录因子E2F，从而满足导致S期所需的基因转录的变化要求，使细胞由G1期进入S期【7岿J。p27蛋白作为一种CDKI，属于CipKip家族，可特异性的阻碍cyclin DCDK46和cyclinECDK2复合物的活化，以此来调控细胞周期由G1期向S期转变，从而抑制细胞的增殖。在Go和G1期，p27蛋白主要分布在细胞核内，并抑制细胞周期蛋白ECDK2活性。当细胞

27、被适当的信号刺激，p27蛋白丝氨酸及苏氨酸残基磷酸化，使p27与cyclin D-CDK4复合物结合以抑制复合物活性，只有当p27蛋白从复合物中释放或降解时，cyclin DCDK4复合物才可以恢复其活性。当p27基因突变或缺失，丧失或减弱p27蛋白对细胞周期的调控作用，细胞增殖的平衡被打破，细胞过度分裂增殖，最终可导致肿瘤的形成【91。正常情况下，cyclin D1会在细胞进入S期后迅速降解，但若编码cyclin D1基因放大或畸形表达，则细胞中cyclin DI的表达维持在一个较高水平，导致细胞周期调控失衡，使G1期缩短，细胞增殖失控、紊乱，分裂速度加快，导致肿瘤的形成16，】oJ。因为在

28、细胞周期中对细胞增殖发挥的调控作用，p27蛋白和cyclinDl在人类恶性肿瘤中的表达通常会发生变化，其表达水平与肿瘤的发生、发展及预后密切关联。包括胃癌在内许多恶性肿瘤的p27蛋白表达均表现为不同程度的降低或缺失，国内外的相当一部分研究表明胃癌组织中p27蛋白的表达明显低于癌旁组织及正常胃组织。cyclin D1作为一种细胞周期的正调控蛋白， cyclin D1的异常的高表达可导致细胞周期调控失衡，致细胞增殖失控而恶性化，cyclin D1过度表达在胃癌的发展过程中起重要作用【11阀。本研究通过分析疣状胃炎活检组织炎症程度、萎缩、肠化及异型增生等病理组织学变化，检测p27蛋白及细胞周期蛋白c

29、yclin D1在慢性浅表性胃炎、不同分型的疣状胃炎组织及胃癌组织中的表达，并比较其与疣状胃炎Hp、肠上皮化生及异型增生的关系，探讨疣状胃炎、胃癌之间的关系及其可能存在的癌变的分子机制，为疣状胃炎及胃癌的预防与治疗提供更多的依据。扬州大学硕士学位论文 10第一部分疣状胃炎的病理分析1 材料和方法11标本收集2012年1月2012年12月胃镜室及手术室符合研究要求的标本，随机采取慢性浅表性胃炎、未成熟型疣状胃炎、成熟型疣状胃炎组织标本各40例。男77例，女43例，年龄2674岁，平均5276岁。所需病例需满足的条件：(1)近4周未服用抑酸药、铋剂、抗生素、非甾体类抗炎药；(2)所有胃炎患者不伴发

30、食管癌、胃癌及消化性溃疡；(3)所有病例均行胃镜检查及病理确诊。疣状胃炎分型标准参照日本学者Kawai K等提出的分类标准131，末成熟型：隆起的病灶主要由组织炎性水肿所致， 病灶隆起较低，其周边高起平缓，坡度小，顶部的脐样凹陷较大较浅；成熟型：隆起的病灶由组织增生引起，增生病灶较高，坡度较陡，顶部的脐样凹陷较小且深，或者无凹陷而呈息肉样隆起。12试剂梯度酒精由蒸馏水与无水乙醇按比例配制。10福尔马林溶液的配制：甲醛溶液10ml、蒸馏水90 m1苏木素染色液的配制：蒸馏水200ml、无水乙醇10ml、苏木精1 g、硫酸钾铝159。伊红染色液的配制： 伊红lg、90酒精溶液100ml。盐酸酒精分

31、化液的配制：浓盐酸lml、75酒精溶液99ml。无水乙醇购自上海振兴化工一厂。苏木精、甲醛、盐酸、伊红购自上海采购供应站化学试剂厂。二甲苯、硫酸钾铝购自中国医药集团上海化学试剂公司。13主要仪器和设备：电子胃镜V70、 260系列 (日本Olympus公司)Adventure分析天平(奥斯康公司)旋转式切片机RM2142(德国LEICA公司BX51系统显微镜(日本Olympus公司)1011型烤箱(上海实验仪器总厂)顾湘：抑癌基因p27编码蛋白与细胞周期蛋白DI在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义 11JEDA801D形态学图形分析系统软件(江苏捷达科技发展有限公司)14方法与步骤141固定及包

32、埋固定： 新鲜组织于10甲醛溶液中固定24h。脱水透明和浸蜡：利用梯度酒精溶液脱水，二甲苯透明，石蜡浸蜡。包埋：当组织块在蜡中下沉且没有气泡产生的时候即可包埋，凝固后可切片。142切片蜡块49m，连续切片。143 HE染色烤片：60(30min)脱蜡：二甲苯I(10min)一二甲苯II(5rain)一无水酒精I(6rain)_无水酒精1I(6min)_95酒精I(6min)_95酒精II(6min)一90酒精(6min)一80酒精(6min)一自来水水洗(2min)染色：苏木素(20min)_自来水水洗(1min)一l盐酸酒精分化(20s)一自来水水洗(1min)一1氨水反蓝(30s)一自来水

33、水洗(1min)一伊红染色(5min)一自来水水洗(30s)脱水透明：80酒精(20s)_90酒精(20s)_95酒精I(20s)一95酒精II(4rain)_无水酒精I(4min)一无水酒精II(4min)一二甲苯I(4min)一二甲苯II(10min)中性树胶封片。144 镜检镜检各组HE染色切片炎症程度、萎缩、肠上皮化生与异型增生几方面的病理学变化。病理诊断标准参照2012年中国慢性胃炎共识意见“4】。15 数据统计以SPSSl60及Excel2003为统计软件，采用贮检验，PO05)。异型增生：未成熟型及成熟型疣状胃炎组均存在一定比例的异型增生。但三组胃炎的异型增生发生率(0、75、1

34、25)两两比较差异无统计学意义(扮O，(15)。扬州大学硕士学位论文HE染色图片；鬻j纂然1 饔黎图7成熟型疣状胃炎伴肠t皮化生(HE，x100)Fig 7 Mature vafioifom gtritlswithInInalIla(HE。100)图8成熟型疣状胃炎伴异型增生(HE100)Fig 8 Mature vafiolifo_ll gastrhismmdysplia(HE。tOO)顾湘：抑癌基冈p27编码蛋白与细胞周期蛋白D1在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义 153讨论疣状胃炎是一种以多发隆起伴脐样凹陷为胃粘膜损害特征的慢性胃炎，又称慢性糜烂性胃炎、痘疹样胃炎，国内外疣状胃炎的发病率

35、报道不一，从约为207一165不等【l引。目前的疣状胃炎的病因尚不清楚，其发生发展的分子机制研究报道较少，发病机制仍需进一步探讨。疣状胃炎典型的内镜表现为胃黏膜局部隆起伴中央脐样凹陷，凹陷表面常有糜烂，隆起性病变一般为多发性，呈圆形、椭圆形或不规则形，直径510mm，隆起高度1-3ram，呈簇状或链状出现在胃窦部，也可出现在胃体及胃底部。日本学者Kawai K等提出的分类标准得到了广泛的认可，他们根据这些隆起病灶的特点将疣状胃炎分为未成熟型及成熟型。有时病变可被误认为作广基的息肉，因为隆起病变的脐样凹陷可能在治疗阶段愈合使其内镜表现不典型，单发的病变有时与IIa型早期胃癌及异位胰腺相似，需依靠

36、病理确诊。急性胃黏膜糜烂由于缺乏周围黏膜隆起易与疣状胃炎区分，且它们一般不呈簇状或链状出现。疣状胃炎的放射学表现与内镜变现相似，为多发黑色空白钡斑伴中央半透明的晕轮16。国内外研究提示疣状胃炎和胃癌的存在密切关系，Cappeil MS等、McLeanA掣181、姚忆蓉等【1 9】均报道了疣状胃炎发生癌变的病例。其中姚忆蓉等人对82例疣状胃炎患者进行随访，最终4例癌变，占488，平均癌变时间21个月，且病理结果均为腺癌，4N患者中3例随访过程中发现未癌变时病理伴有异型增生，另一例伴有肠上皮化生。结合国内外文献及本研究结果发现相当一部分比例的疣状胃炎可伴发肠上皮化生及异型增生，而这两种病理变化作为

37、胃癌的癌前病变具有相当高的癌变率，由此更加证明疣状胃炎具有癌变的倾向，在临床上对疣状胃炎的病理活检应加以重视，需要积极治疗及长期随访。除了临床方面的研究报道，不少分子生物学层面的基础研究也支持疣状胃炎具有癌变的倾向【20-22。ras、p53基因突变，磷脂结合蛋白1(PEBPl)表达的上调和硫氧还蛋白域蛋白5(TXNDC5)表达的下调，p21及p53蛋白表达的上调，抑癌基因PTEN及p16蛋白的失活等这些变化有可能在疣状胃炎的发生发展及癌变的过程中发挥了一定的作用。综合国内文献，疣状胃炎病理萎缩、肠上皮化生及异型增生的发生率报告不一，分别为萎缩27一776，肠上皮化生552847，异型增生69

38、4200。本组疣状胃炎病理表现为不同程度的轻、中、重度炎症反应，与慢性浅表性胃炎相似，其中以轻度炎症为主。40例慢性浅表性胃炎伴肠上皮化生的有3例(75)，无异型增生者。80例疣状胃炎中伴萎缩的有7例，占875，其中未成熟型3例，成熟型4例。伴肠上皮化生的有23例，占2875，其中未成熟型11例，成熟型12例；伴异型增生的有8例，占100，其中未扬州大学硕士学位论文 16成熟型3例，成熟型5例。慢性浅表性胃炎、未成熟型、成熟型疣状胃炎三者间萎缩情况两两比较差异无统计学意义(p005)。肠上皮化生及异型增生作为胃癌的癌前病变，在疣状胃炎中占有相当的比例，未成熟型疣状胃炎、成熟型疣状胃炎两组肠上皮

39、化生率均高于慢性浅表性胃炎组(尸O05)。而三组胃炎的异型增生发生率差异无统计学意义(p0，05)。统计学结果表明，本研究资料中未成熟型及成熟型疣状胃炎在肠上皮化生及异型增生方面均无显著差异，且肠上皮化生发生率高于慢性浅表性胃炎组。虽然本组研究中疣状胃炎异型增生的发生率与慢性浅表性胃炎比较没有显著差异，但却存在有100的发生率，异型增生作为胃癌的癌前病变，仍然值得给予足够的重视。以上结果说明成熟型及未成熟型疣状胃炎均具有一定的癌变潜能，内镜检查一经发现均应性病理活检，并给予积极的治疗及随访。顾湘：抑癌基因p27编码蛋白与细胞周期蛋白D1在疣状胃炎及胃癌组织中的表达及意义 17第二部分p27蛋白

40、、cyclin D1在疣状胃炎及胃癌组织中的表达研究1材料和方法11标本收集2012年1月一2012年12月胃镜室及手术室符合研究要求的标本，随机采取慢性浅表性胃炎、未成熟型疣状胃炎、成熟型疣状胃炎、胃癌组织标本各40例。男107例，女53例，年龄2687岁，平均5621岁。所需病例需满足的条件：(1)近4周未服用抑酸药、铋剂、抗生素、非甾体类抗炎药；(2)所有胃炎患者不伴发有食管癌、胃癌、消化性溃疡；(3)所有胃癌患者未行放化疗；(4)所有病例均行胃镜检查及病理检查确诊。12试剂p27蛋白兔抗人单克隆抗体、cyclin D1兔抗人单克隆抗体、兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒及DAB试剂盒均购自

41、北京中杉金桥生物公司。Hp快速尿素酶法检测试剂盒购白上海惠泰医疗科技公司。柠檬酸溶液的配制：柠檬酸049、柠檬酸二钠3 g、蒸馏水1000ml，PBS溶液的配制：NaCl 859、NaH2P04 029、Na2HP045559、蒸馏水1000ml以上试剂购自中国医药集团上海化学试剂公司。余同第一部分12。13主要仪器和设备NIKON ECLIPSE 80i显微镜(日本Nikon公司)余主要同第一部分13。14方法与步骤141免疫组织化学蜡块切片，68。C烤片20分钟，常规脱蜡，梯度酒精脱水。热抗原修复采用微波法热。微波炉高档加热PH6的柠檬酸缓冲液卜2min使温度升至96。C，切片置于塑料架中

42、放入缓冲液中，微波炉高档20min(96。C)，取出切片自扬州大学硕士学位论文然冷却至室温。滴加3过氧化氢去离子水，37。C孵育10mJl3。PBS冲洗2minx3次。滴加一抗， 4冰箱过夜，PBS冲洗2minx3次。滴加Polymer Heper，37。C孵育20min，PBS冲洗2minX3次。滴加PolyHRP antiRahbiL IgG， 37。C孵育20min，PBS冲洗2minx3次。DAB溶液显色(1mlDAB底物缓冲液中滴加1滴DAB浓缩液)。蒸馏水充分冲洗、苏木素复染、脱水、透明、干燥、封片，PBS代替一抗作为阴性对照。142 Hp检测方法采用快速尿素酶法检测Hp感染情况，

43、取新鲜胃黏膜组织一小块直径约0203rmrn，将其埋入黄色中胶冻样检测试剂中，胃黏膜组织边缘试剂颜色由黄变红者表明Hp阳性，若无颜色变化则为阴性。15结果判定中性树胶封片后显微镜下镜检。免疫组织化学结果按染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定【23】。随机选取5个高倍视野(400)镜检，p27蛋白和cyclinDl的表达主要在细胞核中，棕黄色颗粒为阳性反应。染色强度：无色O分、淡黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分。阳性细胞所占比例：无阳性细胞0分、25 1分、26502分、51753分、754分。两者评分相乘，3分为阴性，3分为阳性。16数据统计采用SPSSl60统计软件及Excel进行x2检

44、验及Spearman等级相关分析，Y005)3、成熟型疣状胃炎组(525)p27蛋白表达阳性率低于慢性浅表性胃炎组(85O)及未成熟型疣状胃炎组(775)(P005)。如弘龉加坫加0O扬州大学硕士学位论文图10_1 7各组免疫组织化学p27蛋白的表达情况囝12未成熟型疣状胃毙畦7蛋自m性嵌达O05)。嬖塑!塑堡兰里!塑塑堡鱼皇塑堕旦塑里旦里!垄壅鲨垦叁墨旦堡望塑!塑垩堕墨苎苎 望图1 926：各组免疫组织化学cyclin D1的表达情况目2I束成熟型疣状竹炎cycllnDI m性寝选(400)Fi921 The positiveIonofcyclinDIinlumvariolifo”gastf

45、ilis(IH，400)圈22来成热型疣状胃擞cyclinDI阴性鞋述(IH-)(4。0Fi925 The posltive cx岬iofl ofcyctinDIin gastric(IH，400)图26胃癌cyclinDI阴性表达(IH。)O999女 27 18 9 10260040 099921300298 063717-_一_-l_一-l_一一如表5所示，疣状胃炎患者的年龄、性别与p27蛋白及cyclinDl的表达无关(P005)24疣状胃炎组中Hp感染与p27、cyclinDl蛋白表达的相关性各胃炎组中Hp感染情况如表6、图27所示。表6三组胃炎患者Hp感染情况Tab 6 The Hp

46、 infection in the three groups of gastritis注：1vs2：矛=5591，P=-0034；lvs3：X2=7813，P=-0010,2vs3：z2=O213，P=0818。鲻匿掣医氢士ii、蠹i譬囊巍t嚣 i。i警i麓蔓纛：。j薏 糍 誉。t嚣 蠹烈，毒，j= t。点 嚣i嚣j 鞲i鬻譬鹭霉i、引 鬟、矗记臂|羔；“j 。 ” 一 v一。 * 。ii r” I； *，i、j。囊黧x藤曩豢纛二_荔二；誊i：i蓦j：墓蒸j i i爹j；蘧j鬟叠i誊i?+， 。，= I一矗 糍、ji“；尊o i=一嚣fi“I i i 。 繁溺。 |-j 莓曩iil l_誊誊i 麟铡， “”薯j 一彰i、薹蓦 i爿 E“囊j i 蠹