免疫组织化学分析.docx

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1、免疫组织化学分析(1) 脱蜡和水化：脱蜡前首先将组织切片在65恒温箱中烘烤20 min；之后将组织切片依次浸泡二甲苯(3次)，每次10min；然后再依次浸泡无水乙醇(2次)、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇、双蒸水，各3 min完成脱蜡和水化，蒸馏水冲去玻片上的酒精。(2) 抗原修复：将枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)倒入不锈钢高压锅中；待溶液沸腾后将玻片置于塑料染色架，缓慢放入锅中，使玻片完全浸没于缓冲液，将盖子锁定，待阀门中有高压蒸汽喷出后，计时2 min，关掉热源。自然冷却至室温，约需11.5 hr。+PBS洗3次，每次3min.(3) 封闭内源过氧化物酶活性：

2、将3% H2O2(现用现配)滴在玻片组织上，放入湿盒内，室温静置2030 min。PBS洗3次，5 min/次。(4) 抗原封闭：将5% BSA(0.5gBSA粉末定容到10mlPBS)滴在玻片组织上，放入湿盒内，室温静置2030 min。(5) 抗孵育：用5% BSA稀释抗体至说明书指定终浓度，将稀释好的抗体50 l100 l滴加至组织上，放入湿盒内，4过夜。PBS洗3次，5 min/次。(6) 抗孵育：滴加抗孵育液4050 l至组织上，放入湿盒内，室温静置20 min。PBS洗3次，5 min/次。(7) DAB显色：A，B液配置比例为50：1，即取1 ml A液，加入1滴B液，混匀即可。

3、将显色液加在组织片上，35 min，在显微镜下掌握染色程度。 (8) 自来水冲洗10 min。 (9) 苏木精复染0.51 min。(10) 自来水冲洗1015 min。 (11) 脱水和透明：将组织切片依次浸泡60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇(2次，2min/次)、二甲苯(3次，5 min/次)。 (与脱蜡、水化过程相反)(12) 中性树脂胶封片：切片从二甲苯中拿出后，勿干片，迅速滴加1滴中性树脂胶在组织片一侧，缓慢放平盖玻片，注意勿使有气泡，若有气泡覆盖在组织上，用二甲苯洗去盖玻片，重新封片。(13) 镜检及统计分析：ISL-1在组织中的染色强度可分为：阴性(阳性细胞比例75%)。评分分别表示为0、1、2、3。阳性率计算为阳性（2）和强阳性（3）例数所占总例数的百分比。染色强度与临床病理参数的相关性分析应用SPSS软件及c2检测进行统计。图像应用 Leica DM25000B 显微镜(Leica, Germany)进行采集。