菌落的PCR鉴定(共2页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上实验六 菌落的PCR鉴定【实验目的】通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。【实验原理】重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR方法对重组子进一步进行快速鉴定。以重组质粒作为PCR扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。【实验步骤】 用200 L的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 L无菌水中， 吹打混匀，从中取2L菌液作为菌落PCR模板。1在200 l PCR 管内配制20 l 反应体系： 反应物 体积/L 模板DNA 2.0 灭菌蒸馏水（ddH2O) 10.3 10PC

2、R 缓冲液 2.0 dNTP （2.5mM） 1.6 引物1 （2M） 2.0 引物2 （2M） 2.0 rTaq 酶 （1.0单位） 0.1 Total 20 2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。3. PCR反应热循环程序设置： 94 预变性 3 min; 94 变性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 3 min; 16 pause反应结束后短暂离心，置4 保存备用。 配制1的琼脂糖凝胶。 4.取5L PCR产物加1L 6loading buffer于1%的琼脂糖凝进行电泳剩余的13 L菌液置4 保存备用。【结果与分析】 3214本实验扩增片段长652 bp。 由图可知，1、4泳道没有条带，说明目的基因没转入感受态细胞。可能的原因是连接体系有外源性核酸酶污染，使T-载体变为平端，连接后由于移码，而生成白斑。而2、3号泳道目的基因已成功转入感受态细胞中，所得片段大小符合目的片段。专心-专注-专业