浙江大学生物化学丙实验报告(共4页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 日期： 2015.5.12 地点： 生物实验中心310 装 订 线实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：_实验名称： 蔗糖酶的提取 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法；2、巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。二、实验内容和原

2、理1、实验内容： 蔗糖酶的提取、分离纯化2、实验原理： 酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。三、实验材料与试剂1、实验材料 市售干酵母粉 10g/组(34人）2、实验试剂石英砂，95%乙醇

3、(-20），20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。四、实验器材与仪器电子天平（称量干酵母粉 ）；研砵（每组一套）；50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）；高速冷冻离心机；恒温水浴箱（50）；量筒（50ml）、微量移液枪（1000ul)及枪头或移液管（1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管（留样品、用）及离心管架 ；制冰机；20冰箱。五、 操作方法和实验步骤1、 酵母细胞破粹（干磨法）称量：称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵研磨(干磨)：至尽可能成细粉末状（约15min）加液+研磨：量取总体积40 ml的20mm

4、ol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加研磨10min， 使呈糊状液体；离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后(托盘天平上)，离心10min （条件：4、12000r/min）收集+测量：收集上清液并量出体积V1（样品I），另留1ml上清液（样品I ）放置20冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析2、热处理水浴热处理：将上步抽提液（样品I），迅速放入50恒温水浴，保温30min， 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10m

5、in。 （条件：4，12000r/min）收集+测量：收集上清液并量出体积V2（样品），另留1ml上清液（样品）放置20冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。3、有机溶剂（乙醇）沉淀冰浴：将热处理后的上清液加入相同体积的20的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀， 放置约20min；离心：转移至两支50 ml离心管中，平衡后，离心10min； （条件：4，12000r/min）收集保存：弃去上清液，用7 mL的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液溶解沉淀 留出1mL溶液，并将余下溶液转移入7 mL塑料离心管， 20冰箱保存。 （用于实验2离子交换柱

6、层析分离纯化蔗糖酶）六、实验数据记录和处理1、实验数据记录石英砂：5.00g；干酵母粉：10.00g；Tris-HCl提取离心后上清液体积（样品）V1：31.5mL；样品热处理离心后上层清液体积（样品）V2：27.0mL。2、实验现象：研磨过程：干酵母颜色变浅，散发出一股难闻的气味；第一次离心后：上清液澄清颜色土黄色；下部沉淀分层，上层酵母细胞碎片等呈棕褐色， 下层石英砂呈白色；第二次离心后：上清液更加澄清橙黄色；沉淀为米白色，较第一次变浅；第三次离心前：上清液柠檬黄，沉淀为米白色。七、实验结果分析讨论1、实验结果：经过研磨破碎的酵母提取液样品（1mL）；将样品经过热处理的样品（1mL）；经过

7、选择性变形和有机溶剂沉淀处理过的样品，用 Tris-HCl pH7.3 缓冲液溶解保存在一只7mL和一只1mL的离心管中（样品、）。注意：所有收集样品均需在管壁外用油性记号笔做好标记，先放在一次性PE手套中，并放入-20 冰箱中保存，用于后续实验。2、结果分析：最后得到的两管沉淀，其中一管为米白色沉淀，另一管夹杂部分黄色沉淀，疑为杂质蛋白,或是由于在加入乙醇时体积比例没有调整好而造成，具体结果有待进一步检测。误差分析：a：称量天平精确度不高，可能会对石英砂和干酵母的称量结果造成误差；b:在研磨过程中，有少部分粉末洒出，存在操作误差；c：在平衡过程中，为了保持平衡用胶头滴管在两支离心管之间进行调

8、节，有部分溶液残留在胶头滴管里。可以将所有的材料放进一支离心管，另外一支离心管加入水，通过改变水的含量达到平衡的效果，以此来减少误差。八、讨论、心得1、实验原理探析石英砂的作用：加入石英砂是为了在研磨过程中增大摩擦力，将酵母细胞充分研磨破裂，提取蔗糖酶；高温水浴：利用了蔗糖酶的耐热性（最受温度为45-50），可以在50的水浴热处理下将不耐热的杂蛋白去除；有机沉淀：乙醇提供疏水的环境，破除蛋白质外层的水膜，从而使提取的蔗糖酶聚集在一起沉淀分离；冰浴作用：使分子运动速度下降，再加以搅拌使之快速沉降。低温操作：防止操作过程温度升高引起有效成分变性。2、思考题：本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的

9、过程中具体运用了哪些方法？你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。答：在本次试验中采用机械法中固体剪切法的研磨法；分离纯化过程用了选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀的方法，后通过离心达到真正分离纯化的目的。其他常用细胞破碎方法：液体剪切法中的超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法以及固体剪切法中的压力法和非机械法中的溶胀和自溶、化学渗透和生物酶降解等。由于蔗糖酶存在于细胞内部，所以需要将细胞破碎以获取蔗糖酶。另外，浓缩方法有沉淀法、吸附法、超过滤法、透析法、减压蒸馏法、冰冻干燥法等。不同的方法都各有优势和缺点，我们要根据不同的实验条件和要求、目的来选择较为适宜的方法。（生物化学技术原理及应用赵永芳 第四版）3、实验感想第一次做生化实验，感觉还是很新鲜。在实验开始研磨的过程中，就有点被一股难闻的味道恶心到了。之后在实验具体操作过程中，发现实验本身比较简单，所以即使第一次实验没有预习，还是能够很快的理解实验的内容。但是之后的实验应该还是比较复杂的，所以需要我们好好预习，并进行一定的思考，以便在下次实验课上能充分的将理论课上所学知识应用到实验中去。专心-专注-专业