克隆载体表达载体构建详细版(共6页).docx-得力文库

资源描述

《克隆载体表达载体构建详细版(共6页).docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《克隆载体表达载体构建详细版(共6页).docx（6页珍藏版）》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、精选优质文档-倾情为你奉上一、稀释引物1、4，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20保存。二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物 0.8ul下引物 0.8ulMix 10ulDNA（日本晴） 1ulDD水 7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物 2ul下引物 2ul5*buffer 10ul dNTPs 5ulDD水 28ulPfu（最后加） 1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入

2、2ml的EP管中。2、按量加XP2，放在55水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。7、套上保鲜膜放入37烘箱中，30min。8、加入DD水 10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20保存。五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物 0.4ul下引物 0.4ulM

3、ix 5ul回收产物 1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25 15min 盖子温度 50之后转化1、提前5min从-70冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。3、水浴锅42，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。4、加入900ulSOC培养基，混匀。5、 37，160r摇床1h，使细菌

4、复苏。6、取出后离心3000r，2min。7、吸出上清，留下100-150ul左右冻在LB 100ml+kana或者A 固体培养基上。8、涂板，37过夜培养。9、挑单菌落（一般不超过7个）加入到10ul的DD水中。菌液PCR体系（10ul体系）上游引物 0.4ul下游引物 0.4ulMix 5ul菌液 1ulDD水 3.2ul之后跑电泳，若有目的条带则继续。七摇菌菌液+LB液体（加抗生素）-L管（过夜摇菌）第二天 500ul菌液+500ul甘油混匀保存2管，其中一管送检，另一管-70保存。若检测结果正确八、提取质粒1、在1.5ul的EP管中收集菌液，10000转，1min，弃上清

5、，重复一次。2、加205ul solution I（提前预热），用枪头打匀，室温静置2min。3、加250ul solution II（提前预热），混匀，室温静置2min。4、加350ul solutionIII，混匀，室温静置2min（有白色丝状物产生）5、 13000转，10min，取700ul上清液于吸附柱中，10000转，1min。6、加500ul HBbuffer，12000转，1min，倒掉废液。7、加700ul DNA wash buffer，13000转，1min，倒掉废液，重复一次。再空离心2min 13000转。8、 37烘箱中干燥5分钟，加50ulDD水溶解，静

6、置2min，离心13000转，2min。九做酶切（50ul）DD水 19ulK-B 5ul质粒 20ulbamI 3ulHIndIII 3ul之后37烘箱，不超过16h十、加5ul lodding buffer 若有条带胶回收。十一胶回收（步骤同四）十二做连接，连接表达载体目的基因（胶回收的） 4ul载体（1300） 1ulDD水 2ulBuffer 2ulT4连接酶 1ul过夜 16 ，水浴连接。十三、连接后转化，同“六”十四、挑条单菌落跑菌落PCR，若有条带，将剩下的9ul +LB液体+K 加入L管过夜培养。十五、取L管500ul与500ul 甘油加入EP管中，并与-70保存将L管剩下的菌液取1ul跑菌落PCR（10ul体系）跑电泳检测结果。十六提质粒十七酶切检测DD水 7ulK-B 1ul质粒 1ulBamI 0.5ulHinIII 0.5ul37 2.5h后可以检测。专心-专注-专业

展开阅读全文