PCR实用技巧 .docx

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1、精品名师归纳总结PCR实 用 技 巧 350784478 金 币 +2 ,VIP+0 : 感 谢 分 享7-1315:43增 加PCR 的 特 异 性 ：1.primersdesign 这是最重要的一步 .抱负的 , 只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长 ,18-24bp, 以保证特异性 .当然不是说越长越好 , 太长的引物同样会降低特异性 ,并且降低产量b.GC%40%60%d.避 免3 端GC rich,e.避免3c. 5 端 和 中 间 序 列 要 多 GC, 以 增 加 稳 定 性最 后 3 个 BASE 不 要 有 GC, 或 者 最 后

2、 5 个 有 3 个 不 要 是 GC 端 的 互 补 , 否 就 容 易 造 成 DIMERf. 避免3端的错配g. 避 免 内 部 形 成 二 级 结 构h. 附加序列 RT site, Promoter sequence加到 5 端, 在算 Tm 值时不算 ,但在检测互补和二级结构是 要加上它们i. 使用兼并引物时 , 要参考密码子使用表 ,留意生物的偏好性 ,不要在 3端使用兼并引物 ,并使用 较高的引物浓度1uM-3uMj. 最好学会使用一种designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar , VectorNTI,Onlinedesgin etal.* 引物的另一个

3、重要参数是熔解温度Tm ）.这是当 50 的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度.Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的 .在抱负状态下 ,退火温度足够低 ,以保证引物同目的序列有效退火 , 同时仍要足够高 ,以削减非特异性结合 .合理的退火温度从 55 到 70 .退火温度一般设定比引物的Tm低5. 设 定 Tm有 几 种 公 式 . 有 的 是 来 源 于 高 盐 溶 液 中 的 杂 交 , 适 用 于 小 于 18碱 基 的 引 物 . 有的是依据 GC 含量估算 Tm. 确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法 .这种方法从序列一级结构和相 邻 碱 基 的 特 性 预 测 引

4、 物 的 杂 交 稳 定 性 . 大 部 分 计 算 机 程 序 使 用 近 邻 分 析 法 . 依据所使用的公式及引物序列的不同,Tm 会差异很大 .由于大部分公式供应一个估算的Tm 值, 全部退火温度只是一个起始点 .可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性.开头低于估算的Tm5 , 以 2为增量 ,逐步提高退火温度 .较高的退火温度会削减引物二聚体和非特异性产物的势成. 为获得正确结果 ,两个引物应具有近似的Tm 值. 引物对的 Tm 差异假如超过 5,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始.假如两个引物 Tm 不同,将退火温度设定为比最低的Tm 低5 或者为

5、了提高特异性 ,可以在依据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环,然后在依据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环 .这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝.2. stabilityof primers定 制 引 物的 标 准 纯 度 对 于 大 多 数PCR应 用 是 足 够 的 . 引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响.定制引物以干粉形式运输.最好在 TE 重溶引物 , 使其最终浓度为 100M.TE 比去离子水好 ,由于水的 pH 常常偏酸 ,会引起寡核苷的水解 . 引物的稳固性依靠于储存条件 .应将干粉和溶解的引物储存在 -20 .以大于 10M浓度溶于 TE 的引物

6、在 -20 可以稳固储存 6 个月, 但在室温 15 到 30 ）仅能储存不到 1 周.干粉引物可以在 -20 储存至少 1 年, 在室温,NH4+也有相同的作用 . MBI 公司的 TAQ 酶就供应了两种 BUFFER, 一种是加 Mg 的一种 是 已经混合了 NH42SO4的, 当然,过 高的阳离子浓 度KCL0.2M时 ,DNA在94度 根 本不会发生变性 ,当然 也 就 无 从 谈 起 PCR 了 .c.polymerase不同公司的酶效有所不同 ,需要 operator自己把握适合的酶的浓度 ,一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase, 所以可能需要的酶的量也要大一些

7、. 另外 , 一般的情形下 , 变性的温度可以使用9092度 ,变 性 的 时 间 也 可 以 缩 短 ,从 而 保 证polymerase的 活 性d.template50ulPCRSYSTEM=humangDNA0.1ug-1ugE.Coli10ng-100ngLamadaDNA0.5ng-5ngPlasmidDNA0.1ng-10ng=4. termperaturea. denaturation常 规 是 94 度 5 分 钟 , GC Rich 的 摸 板 是 95 度 5 分 钟除了 GC Rich 外, 常规的 APPLICATIONS 可以将这部分时间缩短到 1 到 2 分钟,

8、或者在 CYCLE 1 时赐予 较 长 的 时 间 , 而 取 消 开 始 的 denaturationb. annealing重点到了：一般情形下 , 是从 55 度开头 .依据情形协作以Mg 离子浓度进行调整 . 有条件的可以做gradientpcr. 退火 的时间 在 30-60S,时间 短一些 可以得 到更好 的成效 . 由于 ,polymerase在annealing temp.时也会有一些活性 . 所以在 A.T.的时间过长 , 会极大的增加非特异性扩增的风险,另外, 在 对 于 一 些 困 难 户 ,比 如 从 gDNA里 扩 增 大 片 段 ,仍 可 使 用 twostepPC

9、R.5. touchdownPCR原 理 很 简 单 , 但 的 确 是 一 个 很 有 用 的 方 法 . 举 个 例 子 ,ANNEALINGTEMP.55度945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s5130s721min2cycles9430s5030s721min20cycles725min6.热启动hot PCR是除了好的引物设计之外,提高start PCR特异性最重要的方法之一. 尽管 TaqPCRDNA 聚合酶的最佳延长温度在 72 , 聚合酶在室温仍旧有活性.因

10、此, 在进行 PCR 反应配制过程中 ,以及在热循环刚开头,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物.这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增 . 在用于引物设计位置点由于遗传元件的定位而受限时,如 site-directed 突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR尤为有效. 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液 ,并将其置于预热的 PCR仪. 这种方法可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结简 单 便 宜 , 但 并 不 能 完 成 抑 制 酶 的 活 性 , 因 此 并 不 能 完 全 消 除 非 特 异 性 产 物

11、的 扩 增 . 热启动通过抑制一种基本成分推迟DNA 合成, 直到 PCR仪达到变性温度 .包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶,在反应体系达到90 度时,PAUSE,将温度保持在70 度以上 ,手工加入 polymerase, 但这个方法过于烦琐, 特殊是对高通量应用,并简洁造成污染 .其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分, 入镁离子或酶 , 包裹起来 ,或者将反应成分 ,如模板和缓冲液 ,物理的隔离开 .在热循环时 , 因蜡熔化而把各种成分释放出来 并混合 在一 起.有很多 公司提供这 样的 酶.=ampliwaxPCRGemsPerkinElmer TaqBeadHotStartP

12、olymerasePromega MagnesiumwaxbeadsStratagene.=象手动热启动方法一样 ,蜡防护层法比较烦琐 ,易于污染 , 不适 用 于 于 高 通 量 应 用 . 仍有一种方法是使用 inactive DNA Polymerase. polymerase 被抗体抑制失活 ,当变性温度超过 70 度时 , 抗 体 也 变 性 了 , 这 样 polymerase 又 被 激 活 了 .7. BoosterPCR 我们知道 1ug human genomic DNA大约在 3X10 5 幂个模板分子 ,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合 . 当模板的浓度过低

13、 ,比如低于 100 个分子时 , 引物和模板之间就很难发生反应. 引物简洁自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个boosterPCR 我始终找不到合适的词来翻译这个booster .详细是这样的 .开头几个 cycles 保持 primer 的低浓度 ,保证 primer:template的 molar ratio 在 10 7108.以 确 保 开 始 扩 增 的 准 确 性 . 然 后 boostePrimer的 浓 度 到 正 常 的 水 平8. 循环数和长度确定循环数的基本原理是 : 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.由于过多的循环数简洁造成ERRORS和非特异性产物的积累产

14、物 的量不够,优化的1.增加2.如何确增定循加环数,循有一个环方方 法 有 :TEMPLATE数法.分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul, 一起跑电泳分析. 从而确定的循环数做一个 PCR体系,40 循环,50ul,最佳另一个会影响PCR 特异性的是PCR cycling 时在两个温度间变化的速率 rampingrate. 当然是越高越 好 . 不 过 咱 们 大 部 分 条 件 有 限 , 就 那 么 几 台 PCR 仪 , 也 没 有 多 少 挑 选 的 余 的9. thermalcycler PCR 仪的因素我们常常简洁忽视 .长时间的使用后需要调整 PCR 仪, 以保证其

15、能够到达正确的温度 .现在 的 PCR 仪 基 本 上 都 有 自 检 功 能 self-diagnosis.10. PCRadditives 附加物或者说 enhancer 实在是多种多样 . 基本上包括几类 , 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA 结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,削减错配 , 增加产物的长度和产量 . 在 GC Rich 情形中, additive可以造成配对碱基间的的不稳固,从而提高扩增的效率 .而在另一种情形下,additive 由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳固 , 而提高了扩增的忠实性 . 要留意的是

16、,没有万能的enhancer全部通用 , 需要你依据自己的情形 ,最好结合 gradientpcr 挑选最优条件 .可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结=dimethylsulfoxideDMSOupto10%formamideat5%trimethylammoniumdetergentssuchaschlorideTween2010-100uM0.1-2.5%polyethyleneglycolPEG60005-15%glycerol10-15%singlestrandedDNAbindingproteinsGene32protein1nME.colisingle-strande

17、dDNAbindingprotein5uM7Taqdeaza-dGTPforGCrichExtender150uMwith50uMdGTPstratagenePerfectMatchPCREnhancerstratagene Q-solutionQiagen=要留意的是,DMSO,GLYCEROL 等会抑制polymerase的活性 , 所以需要scouting出最适的浓度11. TemplateDNApreparation 提取 DNA 时的试剂会抑制 PCR 反应的顺当进行 .因此需要对 TEMPLATE DNA 进行纯化 .特殊是SDS 的情形下就能剧烈抑制 PCR 的进行 . 可以加入

18、一些 nonionic 试剂,如 Tween, Nonid, Trition 之类的反过来抑制 SDS. 仍有 proteinase K 也要除洁净 , 不然会降解 polymerase.12. Nested PCR简洁点说 设计两对引物 , 一对是长的 , 一对是包含在长引物内的 , 用长引物扩增的产物作为其次次扩增 的 模 板 , 这 样 可 以 增 加 产 物 的 量 . 而 且 可 以 减 少 非 特 异 性 带 和 错 配 的 情 况 .增加PCR的保真性高保真酶高温 DNA POLYMERASE是以单链 DNA 或 RNA 为模板 ,在 dNTP 和一些阳离子的存在情形下 , 在特

19、定的 引 物 指 导 下 按 3-5 方 向 合 成 DNA. 包 括 3 种 类 型a.5-3 方向的 DNA 合成才能 ,没有 3-5 方向的外切酶特性 .如 Taq 及其突变体 .这类酶的合成才能强 ,由于 他 不 纠 正 合 成 中 出 现 的 突 变b. 与 a 类似 ,有合成活性 ,没有 3-5 的外切活性 . 但他们能以 RNA 为模板 ,合成 DNA. 如 Tth DNA Polymerasec.有 DNA 聚合活性 ,没有逆转录活性 ,但有 3-5 方向的外切酶活性 .如 pfu DNA Polymerase. 可以提高忠实 性 . 但 是 这 些 聚 合 酶 的 产 量 比

20、 Taq DNA 聚 合 酶 低 .酶的混合物将 Taq DNA 聚合酶同带有 3 到 5外切核酸酶活性其次种聚合酶混合在一起可以获得比单独 Taq DNA 聚 合 酶 高 的 忠 实 性 , 并 可 以 得 到 高 产 量 及 扩 增 长 模 板 .其他因素除了酶, 高浓度的 dNTP 或镁离子会降低忠实性 . 将 dNTP 的浓度从 200M降低到 25- 50M可以增加精确度假如四种核苷的浓度不同 ,忠实性会受影响 .进行较少的 PCR 循环也会有助于增加忠实性 ,由于可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性.1简介寡聚核苷酸引物的挑选,通

21、常是整个扩增反应胜利的关键.所选的引物序列将打算PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的 Tm 值这个和扩增物产量有关的重要物理参数 .好的引物设计可以防止背景和非特异产物的产生 ,甚至在 RNA-PCR 中也能识别 cDNA 或基因组模板 .引物设计也极大的影响扩增产量：如使用设计粗糙的引物 ,产物将很少甚至没有。而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值 .当然,即使有了好的引物 ,依旧需要进行反应条件的优化,比如调整Mg2+ 浓度, 使 用特 殊 的共 溶剂 如二 甲 基亚 砜、 甲酰 胺和 甘 油. 运算机帮助引物设计比人工设计或随机选取更有效.一些影响 PCR 反

22、应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等 ,易于在运算机软件中被编码和限定.运算机的高速度可完成对引物位置、 长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量运算.通过对成千种组合的检测 ,调整各项参数 , 可提出适合用户特殊试验的引物.因此通过运算机软件挑选的引物的总体“质量 ”由用户在程 序参 数 中设 定） 保证 优 于通 过人 工导 出的 引物 . 需要指出的是 ,引物不必与模板完全同源,因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5端的各种修饰 ,这 种 对 引 物 的 修 饰 不 会 妨 碍PCR 反 应 , 而 会 在 以 后 使 用 扩 增 子 时 发 挥 作 用

23、 .2 基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平稳：扩增特异性和扩增效率.特异性是指发生错误引发的频率. 特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR 扩增子 ,在 EB 染色的琼脂糖凝胶上可见到。引物效率是指在每一PCR 循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度. 引物长度。特异性一般通过引物长度和退火温度掌握.假如 PCR的退火温度设置在近于引物Tm 值 引物/ 模板双链体的解链温度）几度的范畴内,18 到 24 个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的.引物越长 , 扩增退火时被引发的模板越少 .为优化 PCR 反应,使用确保溶解温度不低于54 的最短

24、的引物 , 可获得最好的效率和特异性. 总的来说 , 最好在特异性答应的范畴内寻求安全性.每增加一个核苷酸 ,引物特异性提高 4 倍。这样 ,大多数应用的最短引物长度为18 个核苷酸 .引物设计时使合成的寡核苷酸链+2A+T运算 .而对于较长的引物 ,Tm 值需要考虑动力学参数、从“最近邻位 ”的运算方式得到 ,现有的 PCR引物设计软件大多数都采纳这种方式.引物的 3末端核苷酸组成引物 3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是特别重要的,而引物 3末端最终 5 到 6 个核苷酸的错配应尽可能的少 .假如 3末端的错配过多 , 通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注

25、定要失败. 引物 3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性.应特殊留意引物不能互补 ,特殊是在 3末端 . 引物间的互补将导致不想要的引物双链体的显现, 这样获得的PCR 产物其实是引物自身的扩增 . 这将会在 引 物 双 链 体 产 物 和 天 然 模 板 之 间 产 生 竞 争 PCR 状 态 , 从 而 影 响 扩 增 成 功 . 引物 3末端的稳固性由引物 3末端的碱基组成打算 , 一般考虑末端 5 个碱基的 G.此值的大小对扩增有 较 大 的 影 响 , 负 值 大 , 就 3末 端 稳 定 性 高 , 扩 增 效 率 更 高 , 同 时 也 更 易 于 异 位 引 发 . 需要留

26、意的是 ,引物 3末端应尽量防止 T.试验证明 ,以 T 结尾的引物即使与 T, G 或 C 错配仍可有效延长.PCR产物的长度及在耙序列内的位置全部的运算机程序都供应对 PCR 产物长度范畴的挑选 .一般说来 ,PCR 产物长度对扩增效率有影响 .特定 的 应 用 情 况 下 ,PCR 产 物 长 度 部 分 取 决 于 模 板 材 料 . 预期产物的特定长度常常取决于应用的需要 .如目的是建立测定特异 DNA 片段的临床检验方法 ,120 300bp 的小 DNA 扩增产物可能是最好的 .产物应具有好的特异性和高的产生效率 ,并含有能用于探针捕获杂交试验的足够信息 .这一长度范畴的产物可以

27、通过采纳两步扩增循环方法得到 ,从而削减扩增时间 .其他 PCR方法有不同的正确产物长度 .例如,通过定量的 RNA-PCR检测基因表达时 ,产物应当足够大以便构成竞争性模板 ,这样, 产物和竞争物都能够在凝胶上很简洁的辨论出来. 这些产物一般在250 750bp范围内.补充说明如在 cDNA 序列内找寻 PCR 引物, 需特殊留意两点：第一 ,尽力将引物和产物保持在mRNA 的编码区域内,由于这是生成蛋白质的特殊序列,不像 3末端非编码区域与很多其他mRNA 有同源性。其次 ,尽力把引物放在不同的外显子上 ,以便使 RNA 特异的 PCR产物与从污染 DNA 中产生的产物在大小上相区别. 如

28、 PCR 的目的是克隆一个基因或cDNA 的特异序列 ,产物的大小是依据详细应用预选的.在这里 ,运算机程 序 可 以 提 供 关 于 期望 区 域 侧 翼 选 择 引 物 对 的 信息 . 在挑选用来扩增来自不同物种DNA 的引物时 ,应躲开 mRNA 的 5和 3末端非翻译区序列 ,由于它们可能没有任何的同源性.3 简并引物设计设计简并引物时 ,肯定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度. 很明显 ,我们期望挑选简并度最低的氨基酸 ,达到提高特异性的目的 .充分留意物种对于密码子的偏好性,挑选该物种使用频率高的密码子 ,以降低引物的简并性 .应努力防止 3末端的简并 ,对于大多数氨基酸

29、残基来说 ,意味着引物 3末端不要位于密码子的第三位. 在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤dI ）代替简并碱基.4 测序引物设计当然,测序引物的设计一般都由测序公司来完成,假如需要自己设计的话。那么除了依据上面所提到的可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结引物设计通用标准外,仍需要注意两点：测序引物的特异性的标准把握应当更严格一些,也就是说设计时更优先考虑特异性.由于在测序反应中,假如引物与模板在非预期位置退火并引发链延长,会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读.测序引物的 Tm 值适当高一些 .现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA 聚合酶来催化 ,并采用 PCR 的热循环程序

30、 .选用的测序引物的 Tm 值稍高一些 ,有助于使反应顺当跨过待测模板的二级结构区,也有助于降低非特异反应.5 探针的设计探 针 的 设 计 , 根 据 不 同 的 用 途 各 有 其 设 计 特 点 , 这 里 只 是 就 通 用 的 原 就 进 行 讨 论 ：探针的长短一般在20-50核苷酸之间 ,过长合成成本高 ,且易显现聚合酶合成错误 ,杂交时间长 .太短就特异性下降 .留意 G 和 C 的含量努力掌握在 40-60 ,同时一种碱基连续重复不超过4 个, 以免非特异性杂交产生 .探针自身序列不能形成二聚体,也不能有 “发夹 ”结构存在 ,这一点上的要求就要比一般引物设计严格得多 .假如

31、探针的靶目标是多个基因的混合物,就必需掌握该探针与无关基因之间的 相似性在70%以下. PCR中常见问题分析与对策 PCR产物的电泳检测时间一般认为 PCR产物应在 48h 以内完成电泳检测 ,有些最好于当日电泳检测 ,大于 48h 后带型就会显现不 规 就 , 甚 至 消 失 .Troubleshootingguide1 假阴性,不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备, 引物的质量与特异性 ,酶的质量 , PCR 循环条件 .查找原因亦应针对上述环节进行分析研究. 模板：模板中含有杂蛋白质,模板中含有 Taq 酶抑制剂 ,模板中蛋白质没有消化除净, 特殊是染色体中的组蛋白 ,在

32、提取制备模板时丢失过多 ,或吸入酚 .模板核酸变性不完全 .在酶和引物质量好时,不显现扩增带 ,极有可能是标本的消化处理 ,模板核酸提取过程出了毛病 ,因而要配制有效而稳固的消 化 处 理 液 , 其 程 序 亦 应 固 定 不 宜 随 意 更 改 . 酶失活：需更换新酶 ,或新旧两种酶同时使用 ,以分析是否由于酶的活性丢失或不够而导致假阴性 .需注 意 的 是 有 时 PCR 时 忘 了 加 Taq 酶 或 电 泳 时 忘 了 加 溴 化 乙 锭 . 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称 ,是 PCR 失败或扩增条带不抱负、简洁弥散的常见缘由 .有些批号的引物合成质量有问题 ,

33、两条引物一条浓度高 , 一条浓度低 ,造成低效率的不对称扩增, 计策为：选定一个好的引物合成单位 .引物的浓度不仅要看 OD 值,更要留意引物原液做琼 脂糖凝胶电泳 ,肯定要有引物条带显现 ,而且两引物带的亮度应大体一样 ,如一条引物有条带 ,一条引物无条带 ,此时做 PCR 有可能失败 ,应和引物合成单位协商解决 .如一条引物亮度高 ,一条亮度低 ,在稀释引物时要平稳其浓度 .引物使用过程中应高浓度小量分装储存 ,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分 , 导 致 引 物 变 质 降 解 失 效 . 引 物 设 计 不 合 理 , 如 引 物 长 度 不 够 , 引 物 之 间 形 成 二 聚 体

34、 等 .Mg2+ 浓度： Mg2+ 离子浓度对 PCR扩增效率影响很大 ,浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性 ,浓度过低就 影 响PCR扩 增 产 量 甚 至 使PCR扩 增 失 败 而 不 出 扩 增 条 带 . 反应体积的转变：通常进行PCR 扩增采纳的体积为20l、30l、50l或 100l,应用多大体积进行PCR扩增,是依据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如 20 l后,再做大体积时 ,肯定要重新摸索条件,否就容易失败. 物理缘由：温度对PCR 扩增来说相当重要 .假如变性温度低 ,变性时间短 ,极有可能显现假阴性。退火温度过低 ,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率。退火

35、温度过高,影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率 .有时仍有必要用标准的温度计 ,检测一下 PCR 仪或水浴锅内的变性、退火和延长温度,可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结这也是PCR失败的原因之一. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合 ,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的.2 假阳性引物设计不合适：挑选的扩增序列与非目的扩增序列有同源性, 因而在进行 PCR 扩增时 ,扩增出的PCR 产 物为 非 目的 性 的序 列 . 靶 序列 太 短或 引物 太 短, 容 易出 现假 阳 性. 需 重新 设计 引物 . 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种缘由：一是整个基因组或大片段的交叉污染, 导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：操作时应当心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管 外. 除了酶及其他不耐高温的物质外,全部试剂或器材均应高压消毒.所用离心管及进样枪头均应一 次性使用 .必要时 ,在加标本前 , 反应管和试剂用紫外线照耀 ,以破坏存在的核酸 .二是空气中的小片段 核酸污染 ,这些小片段比靶序列短 , 但有肯定的同源性 .可相互