SMP-QC005检定菌管理规程.doc

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1、. .目的：规X药品微生物室检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物限度检验结果的准确可靠。X围：适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。职责：检测中心起草，质量副总经理批准，微生物室人员执行。内容：1依据：?中国药典?2021版二部、?中国药品检验标准操作规X?2021年版。2.责任2.1.微生物室主管或检测中心经理负责菌种的申购、承受、分发。2.2.微生物室检验人员负责菌种确实认、传代、保存、使用及销毁。3.定义3.1标准菌种是指由中国药品生物制品检定所提供的冷冻枯燥菌。3.2.传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期

2、固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。3.3.工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。3.4.菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻枯燥菌种为第0代。4.程序4.1检定菌的申购检测中心经理每年根据检定菌种的使用情况包括临时检验需要，执行非库存物料申购程序购置， 备注中说明：可以向中检所菌种保藏中心或省市药检所购置冻干菌种标准菌种；也可以直接向省市药检所购置传代用菌种，购置时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。4.2检定菌的接收菌种到达实验室后，由检测中心主任接收菌种，检查其名称和

3、数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在?检定菌接收记录?附表1上，内容包括：名称、数量、编号如有、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于48冰箱中，尽量在2周内完成转种。4.3.检定菌的保存4.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至48冰箱中保存。此法仅用于短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌情况而定，细菌一般为1-3个月，霉菌和芽孢杆菌一般为三个月，或适当延长。4.3.2传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法，也可采用斜面低

4、温保存法保存期短，不建议使用。4.3.2.1甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中参加等体积的无菌甘油浓度20%，即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代G2。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤

5、寒沙门菌。4.3.2.2液体石蜡保存法4.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121灭菌30分钟,置40恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。4.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养完毕后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种外表约 1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20冷冻或28冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等。4.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见?传代用菌种保存方法

6、、保存温度、保存期限?附件1。4.4检定菌的传代检定菌菌种的传代因冻干菌标准菌种与传代用菌种而不完全一样。4.4.1标准菌种的复苏、确认、传代4.4.1.1标准菌种的复苏4.4.1.1.1把冻干菌种管、灭菌毛细滴管1ml、双碟、镊子、营养肉汤培养基或其它适宜培养基数支，移入接种室或超净工作台。4.4.1.1.2将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基或其它适宜的培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。4.4.1.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口翻开，放入

7、灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤培养基或其它适宜的培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养肉汤培养基或其它适宜的培养基，并根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下2472小时细菌需要 2448 的培养物，酵母菌需要72小时的培养物，形成孢子的微生物那么宜保藏孢子，放线菌和丝状真菌那么应培养710 天。最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌121，45分钟。44.1.1.4取出培养物，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活生长，假设不浑浊，在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前，细菌应至少培养1周以上，真菌和酵母菌至少应培养2周以上，并

8、在丢弃之前应高温灭活处理121，45分钟。4.4.1.2标准菌种确实认4.4.1.2.1用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基细菌或玫瑰红钠培养基真菌和酵母菌平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在3035下培养3天细菌；2328下培养5天真菌和酵母菌。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进展保存和鉴定。鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。假设在该平板上发现有其它菌落生长，那么说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污

9、染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新别离挑选纯菌落。4.4.1.2.2菌种确实认结果，记录在?检定菌种鉴定记录?上。4.4.1.2.3各检定菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见?菌种复活、划线用培养基、培养条件?附件2。4.4.1.3标准菌种的传代4.4.1.3.1按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代G1，复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，别离单个纯种菌落，此为第2代G2。4.4.1.3.2菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，作为保存菌种G2，也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此

10、为第3代W3。4.4.1.3.3将第2代G2菌种管冷冻保存，将工作用菌W3于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。4.4.1.3.4取一支冷冻保存的第2代G2菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管第3代G3；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第3代W3。4.4.1.3.5将第3代菌种G3冷冻或低温保存，将生长、转种后的第2代G2菌种经高温灭活处理后丢弃。6.4.1.3.6按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻枯燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。4.4.1.3.7当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用

11、菌种转接下一代工作用菌种。4.4.2传代用菌种的传代当无标准用菌种时，可从省市药检所购置菌种作为传代用菌种，不需经过复溶增菌，但应染色或划线确认。将购回无异常的传代用菌种一般为第3代，根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4代)，同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按“6.3.2的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种仍为第3代。4.4.3工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱 48保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。

12、也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法保存的菌种，进展复苏，直接作为工作用菌种。细菌一般为1-3个月，霉菌和芽孢杆菌一般为三个月，或适当延长。当超过5代，须用传代用菌种传代或重新购置。4.4.4传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丧失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进展自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进展的区域、实验仪器和器具。使用菌株操作时，应备用一瓶原浓度的消毒液或酒精棉，如发生菌种泄漏，应用原浓度消毒液覆盖或乙醇燃烧灭菌，如有人员受伤，微生物室检验人员应立即向检测中心报告以便及时进展处理。4.4.5传代后，并在每一支菌种管上贴上标签，

13、标签内容包括：名称、编号以每次传代的支数顺序编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交微生物室主管、或检测中心主任统一保管。同时及时填写?菌种传代记录?附表2。4.6检定菌种的保管4.6.1检定菌种设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立?检定菌种保存、领用登记台账?附表3。 4.6.2检定菌种的定期检查与鉴定在菌种的保存期间，应每周检查保存菌种冰箱的温度、菌种管的塞子是否松动或生霉，并及时填写?检定菌种观察记录?附表4，如有异常应及时处理。菌种在保存期内均应根据菌种的特性工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每6个月一次检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态及生化特性等工程，假设发现与原菌种变

14、异较大，应重新别离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好?检定菌种鉴定记录?附表5。4.6.3所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供给。4.7检定菌种的领用与使用4.7.1微生物学检验人员根据检验需要，从微生物室主管或检测中心经理领取工作用菌种或传代用菌种，用于日常检验或验证试验，使用后及时填写?检定菌种使用登记台账?附表6，以便追踪菌种使用历史。4.8检定菌种废弃的销毁4.8.1以下情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121、45分钟湿热灭活处理：新一代菌种制备成功后的上一代菌种；使用完后的菌种和带有标准菌种的器具和培养物；超过有效期的菌种；凡被污染、

15、变异、可疑等异常情况菌种；其他应废弃的菌种。4.8.2废弃菌种的销毁由检测中心主任提出申请，交检测中心主任批准后，由微生物室检验人员进展灭活处理，并有其他人在场监视，并填写?废弃菌种物品销毁处理记录?附表7,废弃物料不用检测中心经主任批准,不用监视人。7记录归档本规程涉及的记录由质量管理部保存，保存期5年。8.文件的附件附件1：?传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限?附件2：?菌种复活、划线用培养基、培养条件?9.由文件引出的记录RSMP-QC005-01 检定菌种接收记录附表R(SMP-QC005)-02 菌种传代记录R(SMP-QC005)-03 检定菌种观察记录R(SMP-QC005)

16、-04 检定菌种鉴定记录R(SMP-QC005)-05 检定菌种的使用记录R(SMP-QC005)-06 废弃菌种物品销毁处理记录. .word. .附件1：传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限菌种名称保存方法保存温度保存期限大肠埃希菌CMCC(B) 44 102甘油冷冻管-302年金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003甘油冷冻管-302年枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501液体石蜡管2-81年白色念珠菌CMCC(F) 98 001液体石蜡管2-81年黑曲霉菌CMCC(F) 98 003液体石蜡管2-81年乙型副伤寒沙门菌CMCC (B) 50 094甘油冷冻管-302年附件2：菌种

17、复活、划线用培养基、培养条件菌种名称复活培养基划线用培养基培养温度培养时间大肠埃希菌TSB或营养肉汤TSA或营养琼脂培养基平皿32C24h金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌TSB或改进马丁SDA或玫瑰红钠培养基平皿24C48h黑曲霉7d. .word. .编号：RSMP-QC005-01 检定菌种接收记录 版号：A/0-2021名称及编号数量代数来源接收日期接收人检查情况保存条件编号:R(SMP-QC005)-02菌种传代记录 版号:A/0-2021菌种名称：购进领取日期：来源：传代前保存方法：传代培养基：传代日期传代用菌种编号代数传代后数量传代后代数培养温度时间h操作人去向

18、保存方法菌种传代情况菌落、染色等备注. .word. .编号:R(SMP-QC005)-03 检定菌种观察记录版号:A/0-2021日 期冰箱温度塞子是否松动是否霉变处理措施 观察人. .word. .编号:R(SMP-QC005)-04 检定菌种鉴定记录 版号:A/0-2021菌种名称及编号鉴定原因开场鉴定日期鉴定人复核人年 月 日鉴定工程菌落形态革兰染色显微镜下形态典型生化反响特征鉴定结论日期： 年 月 日菌种名称及编号鉴定原因开场鉴定日期鉴定人复核人年 月 日鉴定工程菌落形态革兰染色显微镜下形态典型生化反响特征鉴定结论日期： 年 月 日备注：. .word. .编号:R(SMP-QC005)-05 检定菌种的使用记录 版号:A/0-2021菌种名称:领用日期 年领用量领用人发放人检品名称检品批号备注：. .word. .编号:R(SMP-QC005)-06 废弃菌种物品销毁处理记录 版号:A/0-2021日期被处理菌种物品名称销毁原因处理方式批准人操作人监视人备注：废弃菌种要标明编号、数量支. .word.