化妆品中抗感染类药物的检测方法.doc

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1、 1 附件 2化妆品中抗感染类药物的检测方法 Determination of Anti-infective Drug in Cosmetics1 范围本方法规定了采用高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中36 种抗感染类药物含量的方法。本方法适用于膏霜类、乳液类、水剂类等化妆品中 36 种抗感染类药物的检测。本方法所包含的 36 种抗感染类药物名称、CAS 号及化学结构式见附表 1。2 方法提要本方法以乙腈为溶剂提取样品中抗感染类药物成分，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，对样品中的 36 种抗感染类药物进行初筛。筛查结果呈阳性的样品，以相应的标准品为对照，根据保留时间和特征离子对的相对丰

2、度比定性，定量离子对峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法中 36 种抗感染类药物的检出限、定量下限及取样量为 0.2g 时最低检出浓度和定量浓度见附表 2。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。3.1 甲醇，色谱纯； 2 3.2 乙腈，色谱纯；3.3 甲酸，色谱纯；3.4 氯化钠。3.5 饱和氯化钠溶液：称取 40g 氯化钠，置于 250mL 磨口锥形瓶中，加入 100mL 水，超声 15 分钟，即得。3.6 含 0.5%甲酸的乙腈溶液：量取 200mL 乙腈于 500mL 容量瓶中，加入 2.5mL 甲酸，用乙腈稀释并定容至刻度，摇

3、匀。3.7 5mmol 乙酸铵缓冲溶液（pH4.0）：称取 0.3854g 乙酸铵于1000mL 容量瓶中，加水 980mL 溶解后，用甲酸调节 pH 至 4.0，加水定容至刻度，混匀，过 0.22m 微孔滤膜。3.8 氯霉素标准储备溶液（氯霉素）= 1.0mg/mL：精确称取10mg（精确至 0. 01mg）的氯霉素对照品，置 10mL 棕色容量瓶中，加入甲醇（3.1）充分溶解后，用甲醇（3.1）定容至刻度，摇匀。该储备液质量浓度为 1.0mg/mL。置于-18冰箱中贮存。3.9 其他组分标准储备溶液（待测组分）= 0.1mg/mL：分别精确称取附表 1 中除氯霉素外其他待测组分对照品各 1

4、0 mg（精确至 0.01mg）置于 100mL 棕色容量瓶中，加甲醇（3.1）使溶解（对于溶解性差的物质可加入少量甲酸或水促进溶解），并用甲醇（3.1）定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为 0.1mg/mL 的标准储备溶液。置于-18冰箱中贮存。3.10 混合标准储备液：分别精确移取各待测组分标准储备溶液（3.8 和 3.9）1.0mL 于 100mL 容量瓶中，用甲醇（3.1）稀释并定容至刻度，作为混合标准储备液。置于-18冰箱中贮存。4 仪器4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪。 3 4.2 分析天平：感量 0.0001g 和 0.00001g。 。4.3 超声波清洗仪。4.4 冷冻离

5、心机。4.5 涡旋混合仪。5 测定步骤5.1 筛查用混合标准溶液的制备分别取混合标准储备液（3.10）适量，用初始流动相进行稀释，配制成氯霉素浓度为 200ng/mL，其他组分浓度为 20ng/mL 的筛查用混合标准溶液。5.2 基质标准工作溶液的制备取与待测化妆品配方相同或相近的基质空白样品 5 份于 15mL 离心管中（0.2g/份），分别加入标准品储备溶液适量，按照样品处理操作步骤处理，配制成氯霉素浓度为200、400、600、800、1000ng/mL，其他组分浓度为20、40、60、80、100ng/mL 的系列溶液（浓度范围可根据实际情况进行调整）。5.3 样品处理准确称取化妆品样

6、品（实际样品或空白样品）0.2g（精确到0.0001g），置于 15mL 离心管中，准确加入 3mL 饱和氯化钠溶液（3.5），涡旋 30s，分散均匀，加入含 0.5%甲酸的乙腈溶液（3.6）5mL，涡旋 30s，超声提取 30min，涡旋混合摇匀，以 8000r/min转速 0冷冻离心 5min，吸取上清液于 10mL 容量瓶中，加水定容至 10mL，混匀，经 0.22m 滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液备用。5.4 仪器参考条件5.4.1 色谱条件 4 色谱柱：C18柱（100mm2.1mm，1.7m）或等效色谱柱；流动相：溶液 A：5mmol 乙酸胺缓冲溶液 pH4.0（3.7），溶液B：

7、乙腈（含 0.1%甲酸），梯度洗脱程序见表 1；表 1 流动相的梯度洗脱程序时间（min）溶液 A（%）溶液 B（%）0982 14199 17199 17.1982 20982流速：0.3mL/min；柱温：40；进样量：5L。5.4.2 质谱参考条件离子源：电喷雾离子源（ESI 源）； 监测模式：正离子、负离子多离子反应监测模式，监测离子对及相关参数设定见附表 3（可根据仪器情况调整）；02min：不进入质谱仪分析， 220min：进入质谱仪分析。5.5 定性判定取供试品溶液与相应标准品溶液，在相同试验条件下测定，样品中如呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被测组分的特征离子峰保留时间与标

8、准溶液对应的保留时间一致，且选择的定性离子的相对丰度比与相当浓度对照品溶液的定性离子的相对丰度比的最大偏差应不超过表 2 的规定，则可以判定样品 5 中存在对应的抗感染类药物成分。表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（k）k50%50%k20%20%k10%k10%允许的最大偏差20%25%30%50%5.6 定量测定取基质标准工作溶液依次测定，以待测组分的系列浓度为横坐标，待测组分的峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立基质标准曲线，其线性相关系数应不小于 0.99。取供试品溶液测定，将对应的定量离子色谱峰面积代入线性回归方程，按“计算”项下公式，计算样品中各组分的含量。6

9、计算 V D = V D m式中： 化妆品中的抗感染类药物禁用物质质量分数，g /g； 供试品溶液中抗感染类药物禁用物质的质量浓度，g/mL；V 样品定容体积，mL；m 样品取样量，g；D 稀释倍数（不稀释则为 1）。相同条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。 6 附表 1 36 种抗感染药物的 CAS 编号、分子式、分子量和结构式序 号中文名称英文名称CAS分子式分子量结构式1甲硝唑Metronidazole443-48-1C6H9N3O3171.162氧氟沙星Ofloxacin82419-36-1C18H20FN3O4361.373环丙沙星Ciprofloxa

10、cin85721-33-1C17H18FN3O3331.344克林霉素Clindamycin18323-44-9C18H33ClN2O5S425.0 5克林霉素磷 酸酯Clindamycin phosphate24729-96-2C18H34ClN2O8P S504.976林可霉素Lincomycin154-21-2C18H34N2O6S406.5 7多西环素Doxycycline564-25-0C22H24N2O8444.4 8米诺环素Minocycline10118-90-8C23H27N3O7457.5 9阿奇霉素Azithromycin83905-01-5C38H72N2O12748.

11、98 7 序 号中文名称英文名称CAS分子式分子量结构式10克拉霉素Clarithromycin81103-11-9C38H69NO13747.9511罗红霉素Roxithromycin80214-83-1C41H76N2O15837.05 12氯霉素Chloramphenicol56-75-7C11H12C2N2O5323.1 13克霉唑Clotrimazole23593-75-1C22H17ClN2344.84NNCl14酮康唑Ketoconazole65277-42-1C26H28Cl2N4O4531.43NNOOONNClClO15氟康唑Fluconazole86386-73-4C13

12、H12F2N6O306.27OHNN NNN NFF16联苯苄唑Bifonazole60628-96-8C22H18N2310.39NN17磺胺吡啶Sulfapyridine144-83-2C11H11N3O2S249.29 18磺胺甲嘧啶Sulfamerazine127-79-7C11H12N4O2S264.3 8 序 号中文名称英文名称CAS分子式分子量结构式19磺胺甲二唑Sulfamethizole144-82-1C9H10N4O2S2270.33 20磺胺甲氧嗪Sulfamethoxypyridazin e80-35-3C11H12N4O3S280.3 21磺胺氯哒嗪Sulfachlo

13、ropyridazine80-32-0C10H9ClN4O2S284.72 22磺胺甲噁唑Sulfamethoxazole723-46-6C10H11N3O3S253.28 23依诺沙星Enoxacin74011-58-8C15H17FN4O3320.3224沙拉沙星Sarafloxacin98105-99-8C20H17F2N3O3385.3625培氟沙星Pefloxacin70458-92-3C17H20FN3O3333.3626氟罗沙星Fleroxacin79660-72-3C17H18F3N3O3369.3427双氟沙星Difloxacin98106-17-3C21H19F2N3O33

14、99.3928莫西沙星Moxifloxacin151096-09-2C21H24FN3O4401.4329诺氟沙星Norfloxacin70458-96-7C16H18FN3O3319.33 9 序 号中文名称英文名称CAS分子式分子量结构式30恩诺沙星Enrofloxacin93106-60-6C19H22FN3O3359.431呋喃它酮Furaltadone139-91-3C13H16N4O6324.2932四环素Tetracycline60-54-8C22H24N2O8444.433土霉素Oxytetracyclin79-57-2C22H24N2O9460.4 34金霉素Aureomyc

15、in57-62-5C22H23ClN2O8478.9 35螺内酯Spironolactone52-01-7C24H32O4S416.5736灰黄霉素Griseofulvin126-07-8C17H17ClO6352.77注：附表 1 参考部分药物临床使用情况排序 10 附表 2 36 种抗感染药物的检出限与定量下限序号化合物检出限 （ng）定量下限 （ng）最低检出浓度（g/g）定量浓度（g/g）1甲硝唑0.0250.0750.250.75 2磺胺吡啶0.0250.0750.250.75 3磺胺甲嘧啶0.0250.0750.250.75 4磺胺甲二唑0.0250.0750.250.75 5磺胺

16、甲氧嗪0.0250.0750.250.75 6磺胺氯哒嗪0.0250.0750.250.75 7磺胺甲噁唑0.0250.0750.250.75 8依诺沙星0.0250.0750.250.75 9沙拉沙星0.0250.0750.250.75 10培氟沙星0.0250.0750.250.75 11氧氟沙星0.0250.0750.250.75 12氟罗沙星0.0250.0750.250.75 13双氟沙星0.0250.0750.250.75 14莫西沙星0.0250.0750.250.75 15诺氟沙星0.0250.0750.250.75 16环丙沙星0.0250.0750.250.75 17恩诺沙

17、星0.0250.0750.250.75 18呋喃它酮0.0250.0750.250.75 19林可霉素0.0250.0750.250.75 20克林霉素0.0250.0750.250.75 21克林霉素磷酸酯0.0250.0750.250.75 22四环素0.0250.0750.250.75 23多西环素0.0250.0750.250.75 24米诺环素0.0250.0750.250.75 25土霉素0.0250.0750.250.75 26金霉素0.0250.0750.250.75 27阿奇霉素0.0250.0750.250.75 28克拉霉素0.0250.0750.250.75 29罗红霉

18、素0.0250.0750.250.75 30氯霉素0.10.313 31螺内酯0.0250.0750.250.75 32灰黄霉素0.0250.0750.250.75 33克霉唑0.0250.0750.250.75 34酮康唑0.0250.0750.250.75 35氟康唑0.0250.0750.250.75 36联苯苄唑0.0250.0750.250.75注：附表 2 参考各组分色谱图出峰顺序排序 11 附表 3 36 种抗感染药物的监测离子对及相关参数设定表序 号物质名称电离 方式母离子 （m/z）Frag.（V）子离子 （m/z）CE（V）1甲硝唑ESI+172.02282.0*18 17

19、2.022128.022 2磺胺吡啶ESI+250.010156.0*16 250.01092.026 3磺胺甲嘧啶ESI+265.022156.0*15 265.02292.018 4磺胺甲二唑ESI+271.130156.0*15 271.13092.025 5磺胺甲氧嗪ESI+281.135156. 0*25 281.13592.025 6磺胺氯哒嗪ESI+285.020155.9*15 285.02092.028 7磺胺甲噁唑ESI+254.122156.0*18 254.122107.918 8依诺沙星ESI+321.140232.0*30 321.140303.135 9沙拉沙星E

20、SI+386.26299. 1*28 386.26342.118 10培氟沙星ESI+334.213233.1*20 334.213290.116 11氧氟沙星ESI+362.230261.1*28 362.230318.218 12氟罗沙星ESI+370.229269.1*28 370.230326.020 13双氟沙星ESI+400.238299.1*22 400.238356.020 14莫西沙星ESI+402.26261.1*24 402.26364.528 15诺氟沙星ESI+320.140233.1*25 320.140276.120 16环丙沙星ESI+332.242231.0*

21、22 332.242288.118 17恩诺沙星ESI+360.229245.1*20 360.229342.220 18呋喃它酮ESI+325.028100.0 *15 325.028281.012 19林可霉素ESI+407.240359.4*20 12 序 号物质名称电离 方式母离子 （m/z）Frag.（V）子离子 （m/z）CE（V）407.240126.125 20克林霉素ESI+425.220377.2*18 425.220126.225 21克林霉素磷酸酯ESI+505.230126.1*30 505.230457.230 22四环素ESI+445.130410.2*18 44

22、5.130427.314 23多西环素ESI+445.26428.2*20 445.26154.028 24米诺环素ESI+458.28441.3*18 458.28283.130 25土霉素ESI+461.24426.1*18 461.24444.218 26金霉素ESI+479.125444.1*20 479.125462.216 27阿奇霉素ESI+749.655591.5*30 749.655116.130 28克拉霉素ESI+748.635158.1*30 748.635590.620 29罗红霉素ESI+837.622158.1*31 837.622679.636 30氯霉素ESI

23、-321.125152.0*15 321.125257.210 31螺内酯ESI+341.120107.0*35 341.120165.065 32灰黄霉素ESI+353.26165.0*20 353.26215.020 33克霉唑ESI+277.14165.1*24 277.14241.020 34酮康唑ESI+531.226244.0*30 531.226489.328 35氟康唑ESI+307.12238.1*15 307.12220.016 36联苯苄唑ESI+311.220243.1*15 311.220165.010注：附表 3 参考各组分色谱图出峰顺序排序；*：定量离子对 13

24、图 1 36 中抗感染药物 HPLC-MS/MS 色谱图123456789101112 14 图 1 36 中抗感染药物 HPLC-MS/MS 色谱图（续）131415161718192021222324 15 图 1 36 中抗感染药物 HPLC-MS/MS 色谱图（续）图中 1-36 号组分为：甲硝唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧嗪、磺胺氯哒嗪、 磺胺甲噁唑、依诺沙星、沙拉沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、双氟沙星、莫西沙星、诺氟沙 星、环丙沙星、恩诺沙星、呋喃它酮、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、四环素、多西环素、米 诺环素、土霉素、金霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、氯霉素、螺内酯、灰黄霉素、克霉唑、酮 康唑、氟康唑、联苯苄唑（参考各组分出峰顺序）。252627282930313233343536