基于rna-seq技术的undifilum oxytropis中苦马豆素含量相关基因的分析-张峰华.pdf

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1、flIIIIIIIHIIIIIIHIHIIIIllllY3；224323分类号： S8j：2uIJ c： !2密缎： 公珏学校代码10712研究生学号l 2014050718西北农林针提大学2Q12届攻读硕士学位研究生学位(毕业)论文基于RNASeq技术的Undifilum oxytropis中苦马豆素含量相关基因的分析学科专业研究方向研 究 生指导教师完成时间螨压置匡堂动物!直述瘗瘟张些坐奎勤且副熬援2Q!Z玺目中国陕鹾杨凌、鼻万方数据Classification code：$8569lassiticationCOd UDC：6159Confidentiality level：迪!i曼Uni

2、versity code：1 07 1 2Postgraduate number：20 1 40507 1 3Thesis for MasterS DegreeNorthwest A蜃F University in 201 7ANALYSIS OF THE DIFFEI之ENIALLYEXPRES SED GENES ABOUT SWrAINSONINEOF(胁移眦UM DX姗DP胳BYRNASEQMai or：Clinical Veterinary MedicineResearch field：Animal clinical diseasesName of Postgraduate：ZHAN

3、G FenghuaAdviser：Associate Professer LI QinfanDate of submission：May，20 1 7Yangling Shaanxi China万方数据研究生学位(毕业)论文的独创性声明本人声明：所呈交的硕士学位(毕业)论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科

4、技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名： 琢峰军 时间：妒17年6月 El时间：妒年6月导师指导研究生学位(毕业)论文的承诺本人承诺：我的硕士研指导下独立开展研究工作及毕业)论文是在我的结果，并严格按照学擞关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定而获得的研究结果。如果违反学校关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。 导师签名：蛳九时叭b|7年月日万方数据关于研究生学位c：-毕-业)论文使用授权的说明本学位(毕业)论文

5、的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阋；同意西北农林科技大学将本学位(毕业)论文的全部或部分内容授权汇编录入中国优秀硕士学位论文全文数据库和中国学位论文全文数据库进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开(或者工作调离)西北农林科技大学后，发表或者使用本学位(毕业)论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按中华人民共和国著作权法等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制

6、、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背中华人民共和国著作权法等有关规定处理并追究法律责任。(保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阏、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇鳊论文)研究生签名=狠晦彳导师签名： 、圭却乙时间：时间：7年占沏f棒多只 | 日羚 j 日万方数据基于RNASeq技术的Undifilum oxytropis中苦马豆素含量相关基因的分析摘要疯草是豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的统称，每年给国内外畜牧业造成巨大的经济损失。疯草的主要毒性成分苦马豆素(swainsonine，SW)是导致采食动物中毒的根本原因。大量研究表明，疯草中普遍存在着产SW的内生真菌

7、弯曲牙管蠕孢菌(Undifilum spp)，它是疯草中SW产生的主要原因，疯草的毒性与疯草内生真菌Undifilum属的数量密切相关。基于本实验室对我国主要疯草内生真菌的分离鉴定和遗传特征研究，对合成SW前体物的筛选，以及对内生真菌的蛋白质组学研究和SW合成相关酶的鉴定，本论文利用无参RNASeq技术，主要对SW含量差异较大的疯草内生真菌(FELlaA5和FEL4F5)进行转录组学研究，并利用生物技术平台筛选出与SW含量相关的差异表达基因，为进一步阐释疯草Undifilum属内生真菌合成SW的机制奠定基础。主要研究结果如下：1分别收集20培养26 d左右的内生真菌FELlaA5和FEL4F5

8、的菌丝进行RNASeq测序，分别得到39M和49M高质量clean reads；从头组装(de novo)获得12，3 12条Unigenes，将其与四大数据库Nr、SwissProt、KEGG和KOG比对进行基因功能注释，共有10，393条Unigenes得到注释；为分析SW含量相关基因提供了参考基因序列。2差异表达分析共鉴定出差异基因2,663个，其中上调基因有1,651个，下调基因有1,012个。KEGG Pathway显著性富集分析发现96条代谢通路，涉及2,224个差异表达基因。GO功能富集分析发现富集到催化活性和氧化还原活性条目的差异表达基因较多。3通过相关生物信息学分析，从差异表

9、达基因中鉴定参与棘豆弯曲牙管蠕孢菌(Undifilum oxytropis)中SW生物合成途径的相关酶，包括酵母氨酸脱氢酶1个、哌可酸氧化酶1个、吡咯啉5羧酸还原酶3个、聚酮合酶16个和细胞色素P450 21个。4从鉴定到的差异基因中挑选11个，进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果表明，1个酵母氨酸脱氢酶基因、1个聚酮合酶基因、ldP450基因表达量下调，1个哌可酸氧化酶基因、3个吡咯啉5羧酸还原酶基因、1个聚酮合酶基因、3d、P450基因表达量上调，这与转录组测序表达趋势相一致，说明本论文通过RNASeq获得的差异表达基因是可靠的。关键词：疯草；内生真菌；苦马豆素；RNASeq

10、；差异表达基因万方数据ANALYSIS OF THE DIFFERENIALLYEXPRESSED GENES ABOUT SWAINSONINECONCENTRATIONS OF UNDIFIL UM OXYTROPISBY RNASEQABSTRACTLocoweeds are the poisonous species of the genera Astragalus and Oxytropis(Fabaceae)the toxic plants have resulted in valuable economic losses to animal husbandryannuaUvThe

11、 primary reason for animal poisoning caused by locoweeds is the bioactivesubstance(Swainsonine，SW)within locoweedsThe toxin in the locoweed is not produceddirectly by the plant but by endophytic fungiMany studies have shown that there 1S aswainsonineproducing fungal endophyte in locoweeds widespread

12、ly,and there is a positiveconelation be眦en swainsonine concentration and the presence of Undifilum oxytropis inlocoweedsIn our lab，the fungal endophytes were isolated and identified which were fromloco、veeds in China,and also analysised genetic polymorphismsEffects of putativeprecursors were investe

13、d by feeding on the production of swainsonine by the endophyticUndifilum oxytropis fungiThe study on the proteomic of locoweed fungal endophytessynthesizing swainsonine were to identify the enzyme related to swalnsonlne biosynthsispathwayThe objective of this study is that RNA sequencing technology

14、was used totranscriptome sequencing of two strains of Undifilum oxytropis of locoweedsBoth of themCan produce indolizidine alkaloids swainsonine，but the swainsonine concentration ofFEL4F5 is nearly fiftyseven times hi#ler than that of FEL lA5Combineded withbiotechnology platform，the differentially e

15、xpressedgenes were selected which wererelated to swainsonine concentrationIt providesresearch of swainsonine biosynthsis pathway inlocoweedsThe main results were as follows：important theoretical basis for the furtherUndifilum oxytropis endophytic fungi of1Using RNAseq technology,39 and 49 million cl

16、ean reads were obtained fromFELlaA5 and FEL4F5，respectivelyIt assembled 12，312 Unigenes by De novoTherewere 1 0393 Unigenes mapped to Nr、SwissProt、KEGG and KOG databaseIt providesreference sequences for analysis of the genes related to swainsonine concentration2In total2,663 genes were identified as

17、 differentially expressed genesAmong them，1,65 1 genes expressed upregulatedly and 1,0 1 2 genes expressed down-regulatedlyTherewere 94 metabolic pathways including 2,224 differentially expressed genes which were万方数据found by KEGGMost of differentially expressed genes were categorized imo catalyticac

18、tivity and oxidoreductase activity terms by GOterm analysis3Among the differentially expressed genes，genes of 5 enzymes，which were relmed toswainsonine biosynthsis pathway in Undifilum oxytropis，were identified by bioinformatics，including 1 saccharopine dehydrogenase，1 L-pipecolate oxidase，3 pyrroli

19、ne5。carboxylatereductase，1 6 polyketide synthase and 2 1 cytochrome P45041 1 differentially expressed genes were selected and quantitive realtime PCR werefurther performed to confirm their expression patterns during two strains of fungalendophytes FEL4F5 and FEL 1A5The results showed that following，

20、1 saccharopinedehydrogenase gene，1 polyketide synthase gene and 1 pyrroline。5carboxylate reductasegene were obviously decreased， while 1 L-pipecolate oxidase gene， 3pyrroline5carboxylate reductase genes，1 polyketide synthase gene，and 3 P450 geneswere increasedwhich is consistent with the results of

21、RNASeqThe results indicate thatthe differentially expressed genes obtained by RNASeq is reliableKEY WORDS：locoweed，endophyticexpreesed genesfungi，swainsonine，RNASeq，differentially万方数据目录文献综述1第一章疯草内生真菌的研究进展111疯草的种类及分布一112疯草中产苦马豆素内生真菌的研究1121疯草中产苦马豆素内生真菌的发现1122疯草毒性与疯草内生真菌的关系一2123疯草内生真菌合成苦马豆素的影响因素213苦马豆素

22、的生物合成机制3131豆类丝核菌中苦马豆素的合成机制3132金龟子绿僵菌中苦马豆素的合成机制一4133疯草内生真菌合成苦马豆素的研究一4第二章转录组学研究进展521转录组学的研究背景一522转录组与转录组学的概念523转录组学研究的目标一524转录组学研究技术和方法5241基于杂交技术的微阵列技术6242基于测序手段的转录组测序技术一6试验研究10第三章RNASeq技术筛选与SW含量相关的候选基因1031试验材料和方法10311菌种10312主要仪器11313主要试剂1 1314 FELlaA5和FEL4F5的培养11315转录组从头组装(de novo)11316 RNASeq及数据分析12

23、317实时荧光定量PCR(qRT-PCR)1332结果与分析15321总RNA的提取及质量检测1 5322 De novo组装15323 RNASeq数据分析20万方数据324苦马豆素含量相关基因的定量分析2233讨论26331测序结果的可靠性验证26332候选基因的表达规律研究26结。论29参考文献30致 谢36作者简介37万方数据第一章疯草内生真菌的研究进展文献综述第一章疯草内生真菌的研究进展疯草(Locoweed)是豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)产苦马豆素有毒植物的统称。长期大量采食疯草会引起动物中毒，严重时死亡，称为“疯草病”(Locoism)。疯草的

24、主要毒性物质苦马豆素(Swainsonine，SW)是植物内生真菌Undifilum oxytropis的次级代谢产物(Zhao et a12013)。SW通过抑制甘露糖苷酶的活性阻碍糖蛋白的合成，引起组织细胞空泡变性，从而导致动物中毒死亡(余永涛等2011)。本章主要对疯草内生真菌的研究进展进行了综述。11疯草的种类及分布疯草主要包括棘豆属和黄芪属这两大类。国外以美国西部最为严重，我国则多见于西北、西南、华北等地。并非所有的棘豆属和黄芪属植物都能引起动物中毒。美国疯草中能引起动物中毒的黄芪属约24种，棘豆属4种。(Ralphs et a11990；Stegelmeieret a11995)。

25、我国已发现的疯草植物有22种棘豆属和23种黄芪属(Huang et a12003)，这45种中有l 1种含有SW，包括8种棘豆属植物和3种黄芪属植物(Tong et a12003)。12疯草中产苦马豆素内生真菌的研究121疯草中产苦马豆素内生真菌的发现美国新墨西哥州立大学是疯草内生真菌研究的发源地，Braun等(1997)初次分离到的疯草内生真菌来自美国绢毛棘豆(0sericea)，受当时鉴定技术限制，并没有对其进一步分类命名。直到1999年，根据真菌的形态学特征，将分离到的内生真菌划分为链格孢属(Alternaria)，并推测疯草内生真菌的感染程度与宿主植物的SW水平密切相关(1999)。B

26、raun等(2003)首次报道了含SW的内生真菌。对分离自8个疯草种群中的埃里格孢菌属(Embellisia)内生真菌进行发酵培养，并在其代谢产物中检测到了SW。Mclain R等(2004)对绢毛棘豆(0Sericea)、密柔毛黄芪(彳mollisimus)和蓝伯棘豆(01ambertii)的叶、茎、花及种子进行内生真菌分离培养，发现这些菌株都可产SW。此后不久，Wang Q等(2006)将分离自甘肃棘豆的内生真菌Embellisia oxytrop&与Braun等分离到的产SW菌株相比，发现二者在形态上极其相似，但未对该菌丝的次级代谢产物进行检测。卢萍(2007，2009)扩增出65株植物

27、的真菌特异性条带，这些植物来自小花棘豆6个地理种群。发现有51株含SW，并成功分离到产SW的内生万方数据2 基于RNASeq技术的Undifilum oxytropis中苦马豆素含量相关基因的分析真菌。Ralphs M H等(2008)从Azeootoui、Apubentissimus、Arnollissimus、A1entiginosus和Dsericea分离出产SW内生真菌，并发现黄芪属中SW的含量比棘豆属的高。之后，余永涛等(2009)对我国7种疯草进行埃里格孢属内生真菌的分离，并从其菌丝中得到SW；在菌株扩大培养的发酵液中同样检测到SW；根据遗传多态性研究结果，将分离的产SW的菌株确定

28、为棘豆埃里格孢属，并发现疯草种类的不同引起内生真菌种间关系的差异。Pryor等(2009)对来自国内外的产SW内生真菌进行了形态学研究，将早先确定为棘豆埃里砖格孢属(Embellisia oxytropis)产SW的内生真菌统一命名为Undifilum oxytrop&。122疯草毒性与疯草内生真菌的关系疯草的主要毒性成分为SW，疯草中普遍存在能够产生SW的内生真菌Undifilumgenus。Braun等(1999，2003)认为疯草的毒性与疯草内生真菌密切相关，疯草与其内生真菌中SW的产量随着内生真菌分离率的升高而增加；McLain R等(2004)给大鼠分别饲喂混合疯草或疯草内生真菌的饲

29、料，结果两组大鼠均表现出相同的疯草中毒症状，且多处组织器官出现空泡变性，主要表现在肾脏、胰脏和肝脏；将疯草种子去皮培植，在培出的植物中没有分离到内生真菌，疯草的毒性也随之消失，该试验充分说明合成SW主要在于疯草内生真菌，疯草毒性与疯草内生真菌密切相关。Ralphs等(Ralphs et a12008，2011)研究结果表明，在含SW的疯草中，不论含量高低均能检测到Undifilum oxytrop&内生真菌，但只能从含量较高的疯草中分离培养该内生真菌；而在不含SW的疯草中，检测不到Undifilum oxytropis内生真菌；由此推断疯草中SW的含量可能受Undifilum oxytropi

30、s内生真菌数量的影响，Undifilum oxytrop&内生真菌是SW合成的关键因素。Cook等对美国疯草中SW含量与内生真菌数量的关系作了进一步研究，结果发现SW含量低于检测阈值，或在检测阈值附近的疯草，其内生真菌的数量相对较少，SW含量较高的疯草，其内生真菌的数量也相对较多；SW的含量与疯草内生真菌数目在不同组织或是同组织的不同部位中也存在差异；再次证实疯草中Undifilum oxytrop&真菌的数量与疯草SW产量密切关联(Cook D al et2009，2011)。总之，Undifilum oxytropis真菌的数量对疯草的毒性起决定性作用，疯草内生真菌数量越多，疯草的毒性越强

31、；抑制Undifilum oxytrop&内生真菌的生长，阻断SW在其中的合成途径，有希望减少或消除疯草的毒性。123疯草内生真菌合成苦马豆素的影响因素据报道，内生真菌的生长繁殖与SW的合成受诸多因素的影响，如植株的生长环境及其内部温度、培养基酸碱度、营养成分缺失、化学试剂、部分生物碱合成的前体物质、真菌本身遗传规律等。Oldrup等(2005)对某些环境条件进行改变，用以研究疯草及其内生真菌合成SW的影响因素，发现pH45或高浓度聚乙二醇有助于提高植株与内生真菌的SW产量；而N、P、K的匮乏或是温度的升高，均不影响SW的含量。Valdez Barillas J万方数据第一章疯草内生真菌的研究

32、进展 3R等(2007)发现经除真菌剂处理的未感染真菌的植株的SW产量显著低于受感染的植株。杨国栋等(2012)发现蔗糖、KEHP04、蛋白胨均显著影响内生真菌的SW产量；疯草内生真菌中SW的含量明显受一些前体物质(如LHis、Pro、Trp、LLys等)的影响；赖氨酸构型的差异也影响着内生真菌SW的产量。研究表明，疯草生长条件的差异、生长繁殖阶段的不同，同样会影响不同组织中疯草内生真菌数量与SW含量。当疯草处于生长旺盛季节时，种子、叶片中内生真菌的数量和SW含量会随着植株的成熟而呈增加趋势(Cook et a12012；B6ttger et a12012)。这一报道进一步说明，Undifil

33、um oxytropis合成SW的能力会随着环境条件的变化而改变，但目前尚未有文献报道这一变化的调控机理。Ralphs等(2008)研究发现疯草种属差异会影响SW含量，分离自黄芪属植物内生真菌SW产量较高，而棘豆属的真菌中SW含量相对较低。余永涛(2009)发现在三种棘豆属植物黄花棘豆、小花棘豆和甘肃棘豆中，随着疯草内生真菌分离率的提高，菌株和宿主植物中SW的含量也增高；而变异黄芪、茎直黄芪、毛瓣棘豆、冰川棘豆等内生真菌的分离率直接关系着植物合成SW的能力，与内生真菌合成SW的能力却无直接关系。例如，与毛瓣棘豆相比，冰川棘豆真菌的分离率明显较高，但其SW含量却很低。Cook等(2013)研究发

34、现SW的合成还受疯草与其内生真菌的基因型、疯草与内生真菌的共生关系的影响。13苦马豆素的生物合成机制131豆类丝核菌中苦马豆素的合成机制L赖氨酸+a酮戊二酸Jr酵母氨酸脱氢上酵母氨酸脱氢Jr亚胺离子中间物T(1R，8aS)反式1羟基吲哚里西啶 苦马豆素T1羰基吲哚里西啶上还原酶 t丫L-哌啶酸乙二酸哌啶丙二酸盐图11豆类丝核茵中SW的生物合成路径Fig11 The biosynthetic pathway of swainsonine in the pathogenic fungusRhizocroniu leguminicola万方数据4 基于RNASeq技术的Undifilum oxytr

35、opis中苦马豆素含量相关基因的分析豆类丝核菌(Rhizocroniu leguminicola)是一种豆科牧草病原菌，动物采食感染这种真菌的牧草后会出现以持续大量流涎为特征的中毒症状。Broguist和Croom等人从该菌的菌丝体中提取到了SW的纯品，这种真菌目前保存在美国标准菌库中。国内张黎等(2003)同样从分离的豆类丝核菌中提取到了纯品SW。之后，Wickwire等初步探讨了豆类丝核菌中SW的合成机理。综述前人对SW合成机制的研究，SW在豆类丝核菌中的合成路径见图11(Harris et a11987；Harris et a11988；Wickwire et a11900a，b；张蕾蕾

36、2014)。132金龟子绿僵菌中苦马豆素的合成机制金龟子绿僵菌属半知菌亚门绿僵菌属，是一种寄生在昆虫内的真菌。1985年，Hino等(1985)从绿僵菌中分离出一种免疫调节剂，并将这种免疫活性物质确定为SW。之后，路宏朝等(2006)对金龟子绿僵菌进行发酵培养，从其发酵液中萃取出SW。李锡杰等(2010)同样从金龟子绿僵菌中成功提取到SW。Sim等(1997)通过对SW合成机理的研究，推测金龟子绿僵菌与豆类丝核菌在SW的合成方面有相似之处。133疯草内生真菌合成苦马豆素的研究目前对疯草内生真菌合成SW的途径还未完全阐释清楚，推测合成SW的前体物主要有L赖氨酸、哌可酸和酵母氨酸。Harris等(

37、1988)研究表明，疯草与豆类丝核菌合成SW的机制相同或相似。Mukherjee S等(2012)使用简并引物、cDNA末端快速扩增(RACE)一PCR和反向PCR技术鉴定Undifilum oxytropis酵母氨酸还原酶的基因序列，通过基因敲除技术探究酵母氨酸还原酶在SW代谢过程中的作用。研究表明，酵母氨酸还原酶的缺失降低了酵母氨酸和赖氨酸水平，但提高了哌可酸和SW的积累。杨国栋等(2012)利用同位素标记进行示踪试验，结果表明疯草Undifilum oxytropis生真菌中有一条经赖氨酸转化为哌可酸最终合成SW的路径。Haili Li等(2012)对疯草内生真菌的蛋白质组学进行了初步研

38、究，鉴定出了许多已知或未知的与SW合成有关的酶。万方数据第二章转录组学研究进展 5第二章转录组学研究进展继人类基因组计划HGP的完成，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等功能基因组学不断涌现，且转录组学是最早发展起来在生物学领域应用广泛的一门技术。该技术补充了蛋白质组数据的单一化，从RNA水平验证了蛋白质组学的分析结果；对非编码RNA的研究扩大了转录组的研究范围；新一代高通量技术的发展扩增了转录组的研究数据，扩宽了转录组的研究领域。本章主要对转录组学的研究背景、转录组学和转录组的概念、转录组学研究的目标、研究技术和方法等进行了综述。21转录组学的研究背景随着人类基因组计划的完成，转录组学、蛋白质组

39、学和代谢组学等多种功能基因组学技术不断涌现，其中最早发展起来的是转录组学，其应用范围最广。转录组学基于整体水平探讨细胞中所有基因及其转录调控的机制，它是组成功能基因组学的重要部分，为基因表达、结构及功能的研究开辟了一个新方向(张春兰等2012)。22转录组与转录组学的概念根据遗传学中心法则，DNA借助mRNA将遗传信息传递给蛋白质。故认为RNA架起了一座DNA与蛋白质问沟通的“桥梁”，转录组则被认为是从RNA分子水平鉴定基因的表达和转录情况(Costa V et a12010；李小白等2013)。凡是与蛋白质翻译相关的mRNA均属于狭义上的转录组；而将同一组织或同一细胞转录的所有编码蛋白质的m

40、RNA和非编码RNA统称为广义上的转录组(张春兰等2012；Costa V et a12010)。23转录组学研究的目标转录组学表明研究基因功能和结构的基本出发点是其生命阶段、组织类型、生理状态及环境条件存在差异。对转录组的了解为研究基因组原件、细胞和组织的分子组成提供了必要的条件，为进一步阐释生物状态与分子机制提供了重要途径(徐振波等2012；祁云霞等201 1)。转录组学的首要目的是：分类处于特定时期某一细胞或组织的所有转录本，不仅指mRNA，还包含非编码RNA，如microRNA；确定转录结构，其依据是基因起始位点、5及3末端、拼接模型和其他一些转录后修饰；量化生理或病理条件下各个发育期

41、每个转录本表达水平的差异(Wang et a12009；Costa V et a12010)。24转录组学研究技术和方法目前转录组研究技术主要包括：建立在杂交技术之上的微阵列技术和利用测序手段万方数据6 基于RNASeq技术的Undifilum oxytropis中苦马豆素含量相关基因的分析的转录组技术。表21对各种研究方法进行了比较(张春兰等2012)。表21三种转录组研究方法的比较Table 2-1 comparision of three kinds of transcriptomics methods241基于杂交技术的微阵列技术基因微阵列技术即基因芯片、DNA芯片或寡核苷酸阵列。该技

42、术基于核酸分子原位杂交技术，将已知序列信息的探针固定在玻璃或尼龙膜等固相支持物表面，然后与样品进行分子杂交，当溶液中带有荧光标记的核酸序列与探针序列互相匹配时，即可形成DNA互补链，此时通过杂交荧光信息的强弱，就可以测定目的基因的表达丰度(吴明煜等2005)。常见的有cDNA芯片和寡核苷酸芯片。242基于测序手段的转录组测序技术转录组测序根据发展的阶段可分为：(1)初期建立在Sanger贝q序基础之上的基因表达序列分析(SAGE)和大规模平行测序技术MPSS、全长cDNA文库和表达序列标签EST文库的测序分析；(2)新兴的借助高通量测序技术(NGS)的RNASeq(RNA Sequence)。

43、2421基于Sanger测序的技术测定DNA序列的Sanger法是通过DNA聚合酶和双脱氧链终止物达到测序目的。大多数基于成本较高Sanger测序技术和部分有效短标签不能与参考基因组一一映射；此外，只能分析一部分转录本，且通常无法区分亚型；鉴于此，无法使用传统测序技术对转录本进行结构注释。作为一种建立在Sanger双脱氧测序法之上的RNA测序技术，SAGE以3末端特定位置单一序列标签(约914 bp)作为识别标记，利用酶切技术对这些序列标签进行分离，再对分离到的短序列进行连接、克隆和测序，然后依据特定序列标签重复出现的次数估算mRNA表达水平(吴琼等2010)。这一技术可对不同类型细胞、不同万

44、方数据第二章转录组学研究进展 7发育程度、不同进化水平与不同生理或病理条件下的差异表达基因进行量化研究。MPSS技术，基于基因测序手段探究细胞内每一个基因的表达情况。该技术主要使用限制性内切酶和荧光检测方法对细胞内所有的cDNA克隆片段末端序列(1620bp)进行测定。这一方法主要应用于：分析差异表达基因，制作转录图谱，在基因表达水平的基础上挖掘新基因等等(Reinartz et a12002；张智俊等2003)。cDNA文库是某一生物所有基因编码的cDNA克隆的统称。其原理是在反转录酶的作用下以mRNA为模板形成eDNA，再与某种载体连接。全长cDNA文库是一个DNA分子群，这个群体是由生物

45、体内全部mRNA反转录获得的。简言之，就是mRNA分子群的一个拷贝(晏慧君等2006)。这种技术快速、经济、有效，是功能基因组研究的一个有利途径。EST文库是长度为300500 bp的5或3端序列。该序列借助大规模测序技术对cDNA文库克隆进行测序，根据EST数目所反映的特定基因的拷贝数，确定基因在特定时间特定组织中的表达量。该技术应用范围较广，如挖掘并鉴定新型基因、探讨比较基因组与生物信息学的关系、构建分子标记、绘制遗传图谱、制作基因芯片等(吴春颖等2008)。2422基于新一代高通量测序技术的RNA-Seq新一代测序技术是在传统测序方法的基础上进行的一次历史性变革，具有低成本、高通量、快速、准确等特点。RNASeq即转录组测序，是转录组分析领域的一种新技术，即是利用高通量测序技术对所有编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA进行序列测定，并反映因基因选择性剪接产生的不同转录本的表达丰度。(1)测序平台杂交技术和分子标签测序技术开启了我们对转录组学这一领域的认识，但毫无疑问，高通量测序平台的市场化彻底改变了转录组学的思维方式(Costa V et a12010)。理论上，所有的高通量测序技术都能用于R