生物技术制药-第三章-基因工程制药课件.ppt

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1、生物技术制药全套生物技术制药全套精品课件精品课件2学习目标学习目标 知识目标知识目标 掌握目的基因的获得和基因工程药物的分掌握目的基因的获得和基因工程药物的分离纯化离纯化 理解基因工程菌的不稳定性理解基因工程菌的不稳定性 了解基因工程菌的培养方式了解基因工程菌的培养方式 能力目标能力目标 能熟练应用基因工程技术。能熟练应用基因工程技术。第三章第三章 基因工程制药基因工程制药2022-4-20生物工程系3本章的重点和难点：本章的重点和难点：重点：重点：1、目的基因的获得2、基因工程菌的不稳定性3、基因工程药物的分离纯化难点：难点：目的基因的获得和基因工程药物的分离纯化2022-4-20生物工程系

2、4第一节 概述意义：意义：自20世纪70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。1982年第一个基因重组产品人胰岛素在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。基因工程技术可生产的药物和制剂包括基因工程技术可生产的药物和制剂包括： （1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； （2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮

3、生长因子、凝血因子； （3）激素，如胰岛素、生长激素； （4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、SOD。2022-4-20生物工程系5基因工程技术生产药物的优点：基因工程技术生产药物的优点： （1 1）利用基因工程技术可）利用基因工程技术可大量大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；床使用提供有效保障； （2 2）可以提供）可以提供足够数量足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的研究，从而扩大这些物质的使使

4、用范围；用范围； （3 3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质；）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质； （4 4）内源生理活性物质在作为药物使用）内源生理活性物质在作为药物使用时存在时存在不足之处，可以通过基因工程和蛋不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去白质工程进行改造和去除除; ; （5 5）利用基因工程技术可）利用基因工程技术可以以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。获得新型化合物，扩大药物筛选来源。2022-4-20生物工程系6我国基因工程药物研究和开发起步晚，基础差。1b 型基因工程干扰素是由我国自行研发的具有国际先进水平的生物高科技

5、成果，于1997年 通过 期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。2022-4-20生物工程系7 基因工程技术基因工程技术定义：定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。2022-4-20生物工程系8第二节第二节 基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程2022-4-20生物工程系9基因工程药物制造的一般流程：基因工程药物制造的一般流

6、程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）成品检定； （9）包装。 1 1、上游阶段：、上游阶段： 首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中（1）、（2）、（3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。 2 2、下游阶段：、下游阶段： 将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研

7、制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（7）、（8） 、（9）等属于下游阶段。2022-4-20生物工程系102022-4-20生物工程系11吉林工程职业学院教案首页吉林工程职业学院教案首页课程名称生物技术制药授课班级任课教师刘子明授课时间授课题目第三节 目的基因的获得 教学目标（从传授知识、训练技能方面说明）： 1、逆转录法获得目的基因 2、化学合成法获得目的基因教学重点、难点：重点：逆转录法获得目的基因 难点：逆转录法获得目的基因 教学进程设计（含教学内容、教学设计

8、、教学方法（手段）、时间分配等）：1、逆转录法获得目的基因 2、化学合成法获得目的基因 时间分配：回顾：5min；讲授：80min；总结：5min教学实施情况及分析：目的基因的获得 逆转录法 化学合成法复习思考题、作业题：逆转录法获得目的基因 ？2022-4-20生物工程系12第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。一、逆转录法一、逆转录法逆转录法是先分离纯化目的基因的逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNAmRNA，再反转录，再反转录成成cDNAcDNA，然后进行，然后进行cDNAcDNA的克隆表达。的克

9、隆表达。2022-4-20生物工程系131 1、mRNAmRNA的纯化的纯化mRNA的特点：3末端含有一多聚腺苷酸组成的末端。方法：亲和层析法2 2、cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成一般 mRNA都带有3polyA，所以可以用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。2022-4-20生物工程系143 3、cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成以cDNA第一链为模板合成第二链。4 4、cDNAcDNA克隆克隆用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。2022-4-20生物工程系15cDNAcDNA片段与载体的连接通常采用下

10、面方法：片段与载体的连接通常采用下面方法：加同聚尾连接加同聚尾连接：在载体和：在载体和cDNAcDNA的的3 3末端加上互补的末端加上互补的同型多聚酶序列。同型多聚酶序列。人工接头连接人工接头连接：所谓人工接头是指：所谓人工接头是指由由人工合成的、连人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断。片断。5 5、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞 逆转录聚合酶反应法逆转录聚合酶反应法: : 该方法是该方法是mRNAmRNA经逆转录合成经逆转录合成cDNAcDNA第一链，第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协不需再合成第

11、二链，而是在特异引物的协助下，用助下，用PCRPCR法进行扩增，特异地合成目法进行扩增，特异地合成目的的cDNAcDNA链，用于重组，克隆。链，用于重组，克隆。2022-4-20生物工程系162022-4-20生物工程系172022-4-20生物工程系18二、化学合成法二、化学合成法只能合成只能合成较小的蛋白质或多肽的编码基因较小的蛋白质或多肽的编码基因。前提前提条件条件：必须知道目的基因的核苷酸排列必须知道目的基因的核苷酸排列顺顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出按相应的密码子推导出DNADNA的碱基序列。的碱基序列。限制：限制：一、

12、不能合成太长的基因。一、不能合成太长的基因。 二、人工合成基因时，二、人工合成基因时，遗传密码的简并遗传密码的简并会会为选择密码子带来很大的困难。为选择密码子带来很大的困难。得到的得到的结果可能与天然基因不完全一致。结果可能与天然基因不完全一致。 三、费用高三、费用高2022-4-20生物工程系192022-4-20生物工程系20吉林工程职业学院教案首页吉林工程职业学院教案首页课程名称生物技术制药授课班级任课教师刘子明授课时间授课题目第四节 基因表达 教学目标（从传授知识、训练技能方面说明）： 1、基因表达 2、宿主细胞的选择 3、宿主细胞的种类教学重点、难点：重点：宿主细胞的选择 难点：宿主

13、细胞的选择 教学进程设计（含教学内容、教学设计、教学方法（手段）、时间分配等）： 1、基因表达 2、宿主细胞的选择 3、宿主细胞的种类时间分配：回顾：5min；讲授：80min；总结：5min教学实施情况及分析：目的基因的获得-基因表达-宿主细胞的选择复习思考题、作业题：宿主细胞的选择？ 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。2022-4-20生物工程系21第四节第四节 基因表达基因表达基因表达概念的示意图 真核生物

14、和原核生物基因表达基因表达过程示意图2022-4-20生物工程系222022-4-20生物工程系23最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。2022-4-20生物工程系24一、宿主细胞的选择一、宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。2022-4-20生物工程系25二、宿主细胞分类二、宿主细胞分类第一类为原核细胞：常用的有大肠杆菌、枯草

15、芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。2022-4-20生物工程系26 大肠杆菌因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 原核细胞原核细胞特点特点: : 因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性、复性才恢复活性。 蛋白质不能糖基化。 产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 其内毒素很难除去。2022-4-20生物工程系272022-4-20生物工程系28 枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。2022-4-20

16、生物工程系29 链霉菌链霉菌 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。2022-4-20生物工程系30 真核细胞真核细胞 酵母酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达2022-4-20生物工程系31 丝状真菌丝状真菌 分泌能力强，能正确进行翻译后分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）加工（肽剪切、糖基化）, ,有成熟的发有成熟的发酵和后处理工艺。酵和后处理工艺。2022-4-20生物工程系32(3) (3) 哺乳动物细胞哺乳动物细胞l 外源基因表达产物可由重

17、组转化的细胞分泌到培养液中，使产物易纯化；l 基因产物糖基化接近天然产物；l 细胞生长慢，生产率低；l 培养条件刻苛，费用高；l表达产物是否致癌尚有疑问。 2022-4-20生物工程系33表达体系表达体系 产产 物物 产生部位产生部位 培养方式培养方式 提提 纯纯 产物活性产物活性 潜在危性潜在危性大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 一般一般 对原核好对原核好 不大不大 融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产 对真核差对真核差 酵酵 母母 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 菌体内菌体内 真核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌

18、可高产可高产 稍复杂稍复杂 天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物 完完 整整 外分泌外分泌 较难成本高较难成本高 简单简单 可达天然可达天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产 产物产物 致癌致癌主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较2022-4-20生物工程系34 目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。三三、大肠杆菌中的基因表达、大肠杆菌中的基因表达1、载体表达载体必须具备的条件： （1）载体能够独立的复制 （2）具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 （3）具有很强的启动子 （4）具有阻遏子

19、 （5）有很强的终止子 （6）有翻译的起始信号常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统2022-4-20生物工程系352022-4-20生物工程系36pBV220pBV220系统国内使用最多的载体系统国内使用最多的载体2 2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 启动子的强弱 核糖体结合位点 SD序列和起始密码子ATG的间距 密码子组成 （3）表达产物的稳定性 （4）细胞的代谢负荷 （5）工程菌的培养条件2022-4-20生物工程系372022-4-20生物工程系38 真核基因在大肠杆菌中的表达

20、形式真核基因在大肠杆菌中的表达形式 以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达； 缺点：只能作抗原用。2022-4-20生物工程系39 以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。2022-4-20生物工程系40 分泌型表达药物基因 优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基； 缺点：产量不高， 信号肽不被切割。2022-4-20生物工程系41吉林工程职业学院教案首页吉林工

21、程职业学院教案首页课程名称生物技术制药授课班级任课教师刘子明授课时间授课题目第五节 基因工程菌的不稳定性教学目标（从传授知识、训练技能方面说明）：教学重点、难点：教学进程设计（含教学内容、教学设计、教学方法（手段）、时间分配等）：时间分配：回顾：5min；讲授：80min；总结：5min教学实施情况及分析：芦丁 讲授 看视频 实验操作 芦丁复习思考题、作业题：为什么可以用重结晶法精制芦丁？基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，分为分为分裂不稳定和结构不稳定分裂不稳定和结构不稳定。 分裂不稳定分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒

22、是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。子代菌的现象。 结构不稳定结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。缺失所致工程菌性能的改变。2022-4-20生物工程系42第五节第五节 基因工程菌的基因工程菌的不不稳定性稳定性常用的基因工程菌基因工程菌种，以及带有质粒的菌菌种 2022-4-20生物工程系43基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策l 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制l 改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略2022-4-20生物工

23、程系44基因工程菌的遗传不稳定性的表现基因工程菌的遗传不稳定性的表现 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种这种 不稳定性具有下列两种表现形式：不稳定性具有下列两种表现形式： 结构不稳定性结构不稳定性 重组重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失观生物学功能的丧失 分裂不稳定性分裂不稳定性 整个重组整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（分子从受体细胞中逃逸（curing）2022-4-20生物工程系45 重组质粒的逃逸率 当含有重组质粒

24、的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。 重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重 组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝 数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧2022-4-20生物工程系46一、基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制一、基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产

25、物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排2022-4-20生物工程系47 二、提高基因工程菌稳定性的策略 1、改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编

26、码基因）2022-4-20生物工程系48 2、施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力2022-4-20生物工程系49 3、分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表 达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌 体的稳定性，在第二级进行表

27、达。2022-4-20生物工程系50 4、控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定2022-4-20生物工程系51 5、控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质粒的稳定性。 例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901

28、) 在不同比生长速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰素的比效价也明显增大.2022-4-20生物工程系52 6、固定化 固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性 基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的 表达率都有了很大提高。 在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质 粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法 后，这种选择压力则可被省去。 不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。2022-4-20生物工程系531、培养基 一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营

29、养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。 三、培养条件对三、培养条件对基因工程菌基因工程菌稳定性的影响稳定性的影响2022-4-20生物工程系542、比生长速率 基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。 基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。2022-4-20生物工程系553、限制性基质 一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长

30、通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响2022-4-20生物工程系564、pH 和溶解氧和溶解氧 pH 和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。 pH 和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的 pH 和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。2022-4-20生物工程系575、外源基因的表达、外源基因的表达 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定 外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造

31、成质粒不稳定。 2022-4-20生物工程系58吉林农业工程职业技术学院教案首页吉林农业工程职业技术学院教案首页课程名称生物技术制药授课班级生物10级任课教师刘子明授课时间2012.3.23授课题目第三节 目的基因的获得教学目标（从传授知识、训练技能方面说明）：通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作教学重点、难点：重点：用碱溶酸沉的方法提取芦丁原理难点：用碱溶酸沉的方法提取芦丁及精制的过程教学进程设计（含教学内容、教学设计、教学方法（手段）、时间分配等）：1、讲授用碱溶酸沉的方法提取芦丁及精制的原理及实验的操作过程2、看教学视频3、用碱溶酸沉的方法提取芦丁实验操作4、用重

32、结晶法精制芦丁的实验操作时间分配：讲授：45min；实验操作：40min；总结：5min教学实施情况及分析：芦丁 讲授 看视频 实验操作 芦丁复习思考题、作业题：为什么可以用重结晶法精制芦丁？2022-4-20生物工程系59第七节第七节 基因工程菌的培养基因工程菌的培养一、一、基因工程菌的培养方式基因工程菌的培养方式二、基因工程菌的发酵工艺二、基因工程菌的发酵工艺三、基因工程菌的发酵设备三、基因工程菌的发酵设备2022-4-20生物工程系60基因工程菌基因工程菌发酵的基本操作方式有：发酵的基本操作方式有： 分批培养分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限分批培养操作简

33、单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限 补料分批培养（半连续）补料分批培养（半连续） 在一次投料发酵的基础上，流加在一次投料发酵的基础上，流加一定量一定量的营养，使细胞进一步的的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物生长，或得到更多的代谢产物 连续培养连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。不断地流加营养，并不断地取出发酵液。 透析培养透析培养 固定化培养固定化培养基因工程菌培养方式基因工程菌培养方式2022-4-20生物工程系61补料分批培养补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间

34、，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。基因工程菌培养方式基因工程菌培养方式2022-4-20生物工程系62连续培养连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一

35、定连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供连续培养可以为微生物提供恒定恒定的生活环境，控制其比生长速率，为的生活环境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了良好的条件。等创造了良好的条件。 但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问题，

36、人们将问题，人们将工程菌的生长阶段工程菌的生长阶段和和基因表达阶段基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。分开，进行两阶段连续培养。在这样的系统中关键的控制参数是在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率诱导水平、稀释率和和细胞比生长速率细胞比生长速率。优。优化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获得最高表达水平或最大产率。得最高表达水平或最大产率。基因工程菌培养方式基因工程菌培养方式2022-4-20生物工程系63透析培养透析培养 透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要透析培养

37、技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液抽出打入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环，在补料分批培养中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度

38、菌体。液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密度菌体。 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响。基因工程菌培养方式基因工程菌培养方式2022-4-20生物工程系64固定化培养固定化培养 固定化培养简单来说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上固定化培养简单来说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的过程。固定化培养便于筛选所需的的特定类群，或达到分离进行培养的过程。固定化

39、培养便于筛选所需的的特定类群，或达到分离的目的。如细菌的平板培养就是典型的固定化培养。的目的。如细菌的平板培养就是典型的固定化培养。 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。基因工程菌的培

40、养方式基因工程菌的培养方式2022-4-20生物工程系65基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1 1）生物材料方面）生物材料方面（2 2）生产目的方面）生产目的方面影响基因工程菌发酵的因素：影响基因工程菌发酵的因素：1 1、培养基的影响、培养基的影响常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺 常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。氨水、

41、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。2022-4-20生物工程系66培养基及灌注式细胞培养袋 基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺2022-4-20生物工程系67基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺2 2、接种量的影响、接种量的影响接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短不利于外源基因的表达，大接

42、种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。2022-4-20生物工程系683 3、温度的影响、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。子的合成水平上。在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达

43、；在在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响转录水平上，可通过影响RNARNA聚合酶的作用或修饰聚合酶的作用或修饰RNARNA聚合酶，来调控基聚合酶，来调控基因表达；温度也可在因表达；温度也可在mRNAmRNA翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达。温度还影响蛋白质的活性和胞内小分子调节分子的量而影响基因表达。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。包含体的形成。基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺2022-4-20生物工程系69基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺4

44、 4、溶解氧的影响、溶解氧的影响溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2DO2值。值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。提高活菌产量。2022-4-20生物工程系705 5、诱导时机的影响、诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。一般在对数生长期或对数生长后期

45、升温诱导表达。6 6、pHpH的影响的影响pHpH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对工程菌的生长和代谢情况，对pHpH进行适当的调节。进行适当的调节。总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。立最佳化工艺。基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺2022-4-20生物工程系71基因工程菌的培养设备基因工程菌的培养设备 应用发酵罐来大规模培养基因工程菌。为了防止工程菌丢失携带的应用发酵罐来大规模培养基因工程

46、菌。为了防止工程菌丢失携带的质粒，保持基因工程菌的遗传特性，因而对发酵罐的要求十分严格。由质粒，保持基因工程菌的遗传特性，因而对发酵罐的要求十分严格。由于生化工程学和计算机的发展，新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。于生化工程学和计算机的发展，新型自动化发酵罐完全能满足这些要求。 常规的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于常规的微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养。不同点在于，微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非，微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。主要目标。 基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物

47、质基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。由于这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得并不需要的蛋白质，因此，培养设备以及设备控制应满足获得高浓度的高浓度的受体细胞受体细胞和和高表达的基因表达产物高表达的基因表达产物。 2022-4-20生物工程系72发酵罐的组成部分有：发酵罐的组成部分有： 发酵罐体发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器、保证高传质作用的搅拌器、 精细的温度控制和灭菌系统、精细的温度控制和灭菌系统、 空气无菌过滤装置空气无菌过滤装置

48、 残留气体处理装置残留气体处理装置 参数测量与控制系统（如参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等）等） 培养液配制及连续操作装置等。培养液配制及连续操作装置等。 基因工程菌的培养设备基因工程菌的培养设备2022-4-20生物工程系732022-4-20生物工程系742022-4-20生物工程系75基因工程菌在发酵培养过程中要求基因工程菌在发酵培养过程中要求 环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。对发酵罐有特殊要求对发酵罐有特殊要求 如要提供菌体生长的最适条件如要提供菌体生长的最适条件 培养过程不得污染培养过程不得

49、污染 保证纯菌培养保证纯菌培养 培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动培养及消毒过程中不得游离出异物，干扰细菌代谢活动基因工程菌的培养设备基因工程菌的培养设备2022-4-20生物工程系761、结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成2、罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角3、与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀4、所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留“死腔”，不得有泄漏5、搅拌器转速和通气应适当6、空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料7、培养液要经化学处理或热处理后才可排放8、发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。9、轴封可采用磁力搅拌或双端面密封基因工程

50、菌的培养设备基因工程菌的培养设备2022-4-20生物工程系77吉林农业工程职业技术学院教案首页吉林农业工程职业技术学院教案首页课程名称生物技术制药授课班级生物10级任课教师刘子明授课时间2012.3.23授课题目第三节 目的基因的获得教学目标（从传授知识、训练技能方面说明）：通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作教学重点、难点：重点：用碱溶酸沉的方法提取芦丁原理难点：用碱溶酸沉的方法提取芦丁及精制的过程教学进程设计（含教学内容、教学设计、教学方法（手段）、时间分配等）：1、讲授用碱溶酸沉的方法提取芦丁及精制的原理及实验的操作过程2、看教学视频3、用碱溶酸沉的方法提取芦丁