生物分离工程-第7章萃取2课件.ppt

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1、v双水相萃取双水相萃取(Aqueous two-phase extraction)是利用是利用物质在互不相溶的两个水相之间分配系数的差异实现物质在互不相溶的两个水相之间分配系数的差异实现分离的方法。分离的方法。v1955年由Albertson首先提出了双水相萃取的概念,此后这项技术在动力学研究、双水相亲和分离、多级逆流层析、反应分离耦合等方面都取得了一定的进展。v到目前为止,双水相技术几乎在所有的生物物质如氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等的分离纯化中得到应用,特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离中。第三节第三节 双水相萃取技术双水相萃取技术 溶液的分相不一定完全依赖于有机溶

2、剂，在一定条件溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相下，水相也可以形成两相( (即双水相系统即双水相系统) )甚至多相。于是有甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。到另一水相中，从而完成分离任务。有机溶剂萃取的不足：有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质许多蛋白质都有都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。聚合物的不相溶性：聚合物的不相溶性：u 主要是由于聚合物分子的空间阻

3、碍作用，相互间无法渗主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗 透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的 水相，所以具有强烈的相分离倾向。水相，所以具有强烈的相分离倾向。u 某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓 度达到一定值，也会形成两相，即聚合物度达到一定值，也会形成两相，即聚合物盐双水相体系盐双水相体系 系统含水量多达系统含水量多达75 %75 %90 % ,90 % ,两相界面张力极低两相界面张力极低, ,有助于有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递保持生物活性

4、和强化相际间的质量传递 分相时间短分相时间短( (特别是聚合物特别是聚合物/ / 盐系统盐系统) ,) ,自然分相时间一般自然分相时间一般只有只有5 515min15min。 双水相萃取技术易于连续化操作。双水相萃取技术易于连续化操作。 目标产物的分配系数一般大于目标产物的分配系数一般大于3 ,3 ,大多数情况下大多数情况下, ,目标产物目标产物有较高的收率。有较高的收率。 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉大量杂质能够与所有固体物质一起去掉, ,与其它常用固液与其它常用固液分离方法相比分离方法相比, ,双水相萃取技术可省去双水相萃取技术可省去1 12 2 个分离步骤个分离步骤, ,使使整个分

5、离过程更经济。整个分离过程更经济。 设备投资费用少设备投资费用少, ,操作简单操作简单, ,不存在有机溶剂残留问题。不存在有机溶剂残留问题。双水相萃取技术的优点双水相萃取技术的优点一、一、 双水相分离理论双水相分离理论1、双水相的形成双水相的形成 v熵增熵增混合混合自发自发v分子间作用力分子间作用力-随着随着Mr的增加的增加,而增大而增大.v聚合物的不相容性聚合物的不相容性-含有聚合物分子的溶液发含有聚合物分子的溶液发生分相的现象生分相的现象.常用聚合物：常用聚合物：聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇无机盐系统聚乙二醇无机盐系统无毒原则无毒原则2、相图、相图 临界点临界点(critical

6、point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如C点。均相区两相区双节线系线u聚合物的分子量越高，聚合物的分子量越高，相分离所需的浓度越低相分离所需的浓度越低u两种聚合物的分子量两种聚合物的分子量相差越大，双节线的形相差越大，双节线的形状越不对称状越不对称。3、物质在两相中的分配、物质在两相中的分配 和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。表示。 CT K= CB Ct、CB分别代表分别代表上相、下相中溶质的浓度上相、下相中溶质的浓度 K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关

7、。与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。1）表面自由能的影响）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对大分子物质表面性质对K影响很大影响很大)2）表面电荷的影响）表面电荷的影响(盐效应：盐效应：两相系统中如存在盐两相系统中如存在盐,对对K影响较大影响较大)3）综合考虑）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验）4）影响分配平衡的参数）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响；聚合物的影响； (2)体系中无机盐离子的影响；体系中无机盐离子的影响； (3)体系体系PH的影响；的影响； (4)体系温度的影响；体系温度

8、的影响； (5)体系中微生物的影响。体系中微生物的影响。1）表面自由能的影响）表面自由能的影响2）表面电荷的影响）表面电荷的影响道南电位道南电位(, Donnan potential):实际双水相系统中有电解质实际双水相系统中有电解质, 当这些离子在两相中当这些离子在两相中K 1, 则两相间产生电位差则两相间产生电位差U2，U1相相1 1和相和相2 2的电位的电位 Z+, Z 分别表示一种盐的正负离子的离子价分别表示一种盐的正负离子的离子价 FF法拉第常数法拉第常数 T温度温度v进一步可证明：进一步可证明：InKi*= InKi+ ZiF(U2-U1)RTKi*i组分带电时在体系中的分配系数组

9、分带电时在体系中的分配系数 Kii组分不带电时在体系中的分配系数组分不带电时在体系中的分配系数 Zii组分的离子价组分的离子价意义：意义：A 荷电溶质的分配系数的对数与荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比溶质的净电荷数成正比.B 由于同一双水相系统中添加不由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的同的盐产生的不同不同,故故k与与Zi的的关系因盐而异。关系因盐而异。3）综合考虑）综合考虑4）影响分配平衡的参数）影响分配平衡的参数(1)聚合物的影响聚合物的影响vA A 聚和物的分子量的影响聚和物的分子量的影响 当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的当聚合物的分子量降低时，蛋白质

10、易分配于富含该聚合物的相。相。例如在例如在PEGDeX系统中，系统中，PEG的分子量减小，会使分的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。vB B 成相聚和物浓度的影响成相聚和物浓度的影响 当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近于于1。 如如成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总浓度增加时，成相聚合物的总浓度或聚合物盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界

11、点系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大也增大，蛋白质趋向于向一侧分配蛋白质趋向于向一侧分配，即，即分配系数或增大超过分配系数或增大超过1，或减小低于，或减小低于1。(2)体系中无机盐离子的影响体系中无机盐离子的影响v盐离子在两相中有不同的分配，因而盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差在两相间形成电位差，由于各相要保持电中性由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取来说萃取来说 ,盐的存在就会使系统的电荷状态改变盐的存在就会使系统的电荷状态改变 ,从而对分从而对分配产生显著影响。

12、配产生显著影响。 v盐的种类对双水相萃取也有一定的影响盐的种类对双水相萃取也有一定的影响 ,因此变换盐的种类因此变换盐的种类和添加其他种类的盐有助于提高选择性。和添加其他种类的盐有助于提高选择性。v在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在在 PEG/磷酸盐磷酸盐 /水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由 4提高到提高到 1 2 0 ,而在而在 PEG/DeX/水体系中只从水体系中只从 1 . 55提高到提高到 5。(3)体系体系PH的影响的影响vpH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白会影响蛋白质中可以

13、离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。质所带电荷和分配系数。vpH也影响磷酸盐的离解程度，若改变也影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4-和和HPO42-之间之间的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。的比例，也会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变23个数量级。个数量级。交 错 分 配 法交 错 分 配 法 ( c r o s s partitioning): 当加入不当加入不同种类的盐时，由于相间电同种类的盐时，由于相间电位不同，位不同，lnlnk kpHpH关系曲线关系曲线也不一样。但在也不

14、一样。但在pIpI处，处，k k应应相同，即两条关系曲线交于相同，即两条关系曲线交于一点。所以一点。所以, , 通过测定不同通过测定不同盐类存在下盐类存在下lnlnk kpHpH曲线的曲线的交点交点, ,可测定蛋白质可测定蛋白质/ /细胞器细胞器以及微粒的以及微粒的pIpI。血清蛋白血清蛋白(4)体系温度的影响体系温度的影响 温度影响小温度影响小, , 一般温度改变不影响产物的萃取一般温度改变不影响产物的萃取。 大规模操作大规模操作一般在室温下进行一般在室温下进行, ,不需冷却不需冷却。这是基。这是基于：于：(1) (1) 成相聚合物成相聚合物PEGPEG对蛋白质有稳定作用对蛋白质有稳定作用,

15、 ,常温下常温下蛋白质不会发生变性蛋白质不会发生变性; ;(2) (2) 常温下溶液粘度较低常温下溶液粘度较低, ,容易相分离容易相分离; ;(3) (3) 常温操作节省冷却费用常温操作节省冷却费用. . 二、二、 双水相萃取技术的应用双水相萃取技术的应用 1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。目前已知的胞内酶约目前已知的胞内酶约2500种，种，但投入生产的很少但投入生产的很少。原因之一是提取困难原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小

16、的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。及酶的进一步精制。 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中； 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；经过一次萃取，就能得到高的收率； 两相用离心机很容易分离。两相用离心机很容易分离。工程方面的问题工程方面的问题 在进行工业应用时，需考虑达到萃取平衡所需的时在进行工业应用时，需考

17、虑达到萃取平衡所需的时间和两相分离的设备。间和两相分离的设备。 在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进在两水相系统中，虽黏度高，但表面张力很低。因而进行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且行搅拌时很易分散成微滴，故几秒钟即能达到平衡，且能耗也很少。能耗也很少。 两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理两相分离则比较困难，这是由于两相密度差低和当处理匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采匀浆液时，粘度较大。由于粘度较高会引起阻塞，可采用自动排渣的喷嘴分离机。用自动排渣的喷嘴分离机。PEG/盐更适合用重力沉降；盐更适合用重力沉降； PEG/DeX多用离心机多用

18、离心机。在两水相系统中进行生物转化，如酶促反应，可以把产在两水相系统中进行生物转化，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取萃取生物转化生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把两水相系统称为发酵，因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应器。两水相反应器。2. 两水相反应器两水相反应器enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenzymeenz

19、ymeenzyme要进行要进行两水相生物转化两水相生物转化反应应满足下列条件：反应应满足下列条件： 催化剂应单侧分配；催化剂应单侧分配； 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分配在另一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，一相中；要有合适的相比。如产物分配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。则相比要大，反之则相比要小。这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此这些条件不可能同时满足，分配理论也不完善，因此常需要根据试验选择最优系统和操作条件。常需要根据试验选择最优系统和操作条件。采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：采用两水相系统进行生

20、物转化反应有下列优点： 与固定床反应器相比，与固定床反应器相比，不需载体不需载体，不存在多孔载体，不存在多孔载体中的扩散阻力，故中的扩散阻力，故反应速度较快，生产能力较高反应速度较快，生产能力较高； 生物催化剂在两水相系统中生物催化剂在两水相系统中较稳定较稳定；两相间表面张；两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液力低，轻微搅拌即能形成高度分散系统，分散相液滴在滴在10m m以下，有很大的表面积，以下，有很大的表面积，有利于底物和有利于底物和产物的传递。产物的传递。 初期的双水相萃取过程仍以间歇操作为主初期的双水相萃取过程仍以间歇操作为主。近年来近年来,在天冬酶、乳酸脱氢酶、富

21、马酸酶与青在天冬酶、乳酸脱氢酶、富马酸酶与青霉素酰化酶等多种产品的双水相萃取过程中均采霉素酰化酶等多种产品的双水相萃取过程中均采用了用了连续操作连续操作,有的还实现了有的还实现了计算机过程控制计算机过程控制。 这不仅对提高生产能力这不仅对提高生产能力,实现全过程连续操实现全过程连续操作和自动控制作和自动控制,保证得到高活性和质量均一的产保证得到高活性和质量均一的产品具有重要意义品具有重要意义, 而且也标志着双水相萃取技术而且也标志着双水相萃取技术在工业生产的应用正日趋成熟和完善。在工业生产的应用正日趋成熟和完善。三、三、 双水相萃取技术的发展双水相萃取技术的发展 双水相分配技术作为一个很有发展

22、前途的分离单元双水相分配技术作为一个很有发展前途的分离单元,除了具有上述独特的优点外除了具有上述独特的优点外,也有一些也有一些不足之处不足之处,如如易乳化、易乳化、相分离时间长、成相聚合物的成本较高、分离效率不高等相分离时间长、成相聚合物的成本较高、分离效率不高等,一定程度上限制了双水相分配技术的工业化推广和应用。一定程度上限制了双水相分配技术的工业化推广和应用。 如何克服这些困难如何克服这些困难,已成为国内外学者关注的焦点已成为国内外学者关注的焦点,其其中中“集成化集成化”概念的引人给双水相分配技术注入了新的生概念的引人给双水相分配技术注入了新的生命力命力,双水相分配技术与其他相关的生化分离

23、技术进行有双水相分配技术与其他相关的生化分离技术进行有效组合效组合,实现了不同技术间的相互渗透实现了不同技术间的相互渗透,相互融合相互融合,充分体现充分体现了集成化的优势了集成化的优势。例如：。例如： (1)与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等实现集成化溶胶技术等实现集成化,改善了双水相分配技术中诸如成改善了双水相分配技术中诸如成相聚合物回收困难、相分离时间较长、易乳化等问题相聚合物回收困难、相分离时间较长、易乳化等问题,为为双水相分配技术的进一步成熟、完善并走向工业化奠定双水相分配技术的进一步成熟、完善并走向工业化奠定了基础。了基础。

24、 (2)与亲和沉淀、高效层析等新型生化分离技术实现与亲和沉淀、高效层析等新型生化分离技术实现过程集成过程集成,充分融合了双方的优势充分融合了双方的优势,既提高了分离效率既提高了分离效率,又简又简化了分离流程。化了分离流程。 (3)在生物转化、化学渗透释放和电泳等中引入双水在生物转化、化学渗透释放和电泳等中引入双水相分配相分配,给已有的技术赋予了新的内涵给已有的技术赋予了新的内涵,为新分离过程的诞为新分离过程的诞生提供了新的思路。生提供了新的思路。 1. PEG衍生物：在衍生物：在PEG上引入亲和基团或上引入亲和基团或离子基团；离子基团； 2. 采用多级萃取。采用多级萃取。第四节第四节 反胶团萃

25、取反胶团萃取一、一、概述概述 反胶团反胶团(Reversed Micelles)是是两性表面活性两性表面活性剂剂在在非极性有机溶剂非极性有机溶剂中中亲水性基团自发地向内聚集亲水性基团自发地向内聚集而成的，而成的，内含微小水滴内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。热力学稳定的有序构造。v微胶团微胶团：水溶液中水溶液中 表面活性剂的极表面活性剂的极 性头朝外，疏水性头朝外，疏水 的尾部朝内，中的尾部朝内，中 间形成非极性的间形成非极性的 “核核”水水非极性的非极性的“

26、核核”极性极性“头头”非极性非极性“尾尾”v反胶团反胶团：非极性有机溶剂中非极性有机溶剂中，表面活性剂的极表面活性剂的极 性头朝内，疏水性头朝内，疏水 的尾部向外，中的尾部向外，中 间形成极性的间形成极性的“核核”非极性有非极性有机溶剂机溶剂极性极性“头头”极性的极性的“核核”非极性非极性“尾尾”反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能：功能： (1)具有分子识别并允许选择性透过的具有分子识别并允许选择性透过的半透膜半透膜的功能；的功能； (2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性。保持活性。反

27、胶团萃取的优点反胶团萃取的优点(1)有很高的萃取率和反萃取率，并具有选择性；有很高的萃取率和反萃取率，并具有选择性；(2)分离、浓缩可同时进行，过程简便；分离、浓缩可同时进行，过程简便；(3)能解决蛋白质能解决蛋白质(如胞内酶如胞内酶)在非细胞环境中迅速失在非细胞环境中迅速失 活的问题；活的问题；(4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；质和酶；(5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。二、反胶团的形

28、成二、反胶团的形成1、反胶团的构造反胶团的构造： 在胶体化学中，向在胶体化学中，向水溶液水溶液中加入表面活性剂，中加入表面活性剂，并使其并使其浓度超过一定数值时，浓度超过一定数值时，表面活性剂就会在水相中形成表面活性剂就会在水相中形成胶体或胶体或微胶团微胶团，它是表面活性剂的聚集体。其亲水性的极性端向外，它是表面活性剂的聚集体。其亲水性的极性端向外指向水溶液，疏水性的非极性指向水溶液，疏水性的非极性“尾尾”向内相互聚集在一起。向内相互聚集在一起。 当向当向非极性有机溶剂非极性有机溶剂中加入表面活性剂，中加入表面活性剂，并使其浓度超并使其浓度超过一定数值时，过一定数值时，也会在非极性溶剂内形成表

29、面活性剂的聚集也会在非极性溶剂内形成表面活性剂的聚集体。与在水相中不同的是，其疏水性的非极性尾部向外，指体。与在水相中不同的是，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反，因而称之为向相反，因而称之为反胶团或反向胶团反胶团或反向胶团。构成反胶团的表面活性剂种类：构成反胶团的表面活性剂种类：v阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂AOTv阳离子表面活性剂阳离子表面活性剂季铵盐季铵盐v非极性有机溶剂：环己烷，庚烷，非极性有机溶剂：环己烷，庚烷， 辛烷等辛烷等分离蛋白质时，分离蛋白质时， 使用最多的是阴离子型表

30、面活性剂使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT。2、反胶团的物理化学特性及制备、反胶团的物理化学特性及制备（1）反胶团的物理化学特性反胶团的物理化学特性 反胶团的反胶团的临界胶团浓度临界胶团浓度v表面活性剂在非极性有机溶剂中能形成反胶团的最小浓度表面活性剂在非极性有机溶剂中能形成反胶团的最小浓度 反胶团反胶团含水率含水率W W=C水水/C表表 W越大，反胶团的半径越大越大，反胶团的半径越大（2）反胶团的制备反胶团的制备 注入法注入法 相转移法相转移法 溶解法溶解法v（1）注入法注入法 将含有将含有蛋白质的水溶液蛋白质的水溶液直接直接注入到含有表面性注入到含有表面性剂的非极性有机溶剂中去剂的非极性

31、有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶，然后进行搅拌直到形成透明的溶为止。这种方法的过程较快并可较好地控制反胶团的平均直为止。这种方法的过程较快并可较好地控制反胶团的平均直径含水量。径含水量。v（2）相转移法相转移法 将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活剂将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活剂的非极性有机溶剂中形成反胶团的非极性有机溶剂中形成反胶团-蛋白质溶液。即蛋白质溶液。即将含蛋白将含蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相质的水相与含表面活性剂的有机相接触，在缓慢的搅拌下，接触，在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质转入（萃入）有机相。此过程较慢，但最终的一部分蛋白质转入（萃入）有机相。此过程较慢，

32、但最终的体系处于稳定的热力学平衡状态，这种方法可在有机溶剂相体系处于稳定的热力学平衡状态，这种方法可在有机溶剂相中获得较高的蛋白质浓度。中获得较高的蛋白质浓度。v（3）溶解法溶解法 对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶团对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶团（W3-30）的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋）的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质的反胶团白质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质的反胶团也是稳定的，这也说明反胶团也是稳定的，这也说明反胶团“水池水池”中的水与普通水的性中的水与普通水的性质是有区别的。质是有区别的。1、反胶团萃取

33、原理反胶团萃取原理v蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层 , ,同邻近同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形的蛋白质分子发生静电吸引而变形 , ,接着两界面形接着两界面形成含有蛋白质的反胶团成含有蛋白质的反胶团 , ,然后扩散到有机相中然后扩散到有机相中 , ,从从而实现了蛋白质的萃取。而实现了蛋白质的萃取。( (可能机理可能机理）v改变水相条件改变水相条件 ( (如如pHpH值、离子种类或离子强度值、离子种类或离子强度 ) ,) ,又可使蛋白质从有机相中返回到水相中又可使

34、蛋白质从有机相中返回到水相中 , ,实现反萃实现反萃取过程。取过程。 三、三、 反胶团萃取的理论基础反胶团萃取的理论基础2、蛋白质的溶解模型、蛋白质的溶解模型a、水壳模型：、水壳模型：蛋白质位于水蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；其与反胶团壁隔开；b、半岛模型：、半岛模型：pro表面存在表面存在强烈疏水区，该区直接与有机强烈疏水区，该区直接与有机相接触；相接触；c、pro吸附于反胶团内壁；吸附于反胶团内壁；d、pro疏水区与几个反胶团的疏水区与几个反胶团的疏水尾发生相互作用，被几个疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所小反胶团所“溶解溶解”。3、影

35、响反胶团萃取的作用力、影响反胶团萃取的作用力1）决定分配系数的分离场）决定分配系数的分离场-分离物质间的相互作用分离物质间的相互作用 溶解推动力溶解推动力 静电作用：静电作用：理论上理论上,当溶质所带电荷当溶质所带电荷与表面活性剂相反时与表面活性剂相反时,由由于静电引力的作用于静电引力的作用,溶质溶质易溶于反胶团易溶于反胶团,溶解率或溶解率或分配系数较大分配系数较大,反之反之,则不则不能溶解到反胶团相中能溶解到反胶团相中左图为左图为pH值对不同蛋白值对不同蛋白质的溶解率急剧变化质的溶解率急剧变化,当当pHpI ,即在带正电荷的即在带正电荷的pH范围内蛋白质的溶解范围内蛋白质的溶解率接近率接近1

36、00%,说明说明静电相静电相互作用互作用对蛋白质的反胶团对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用萃取起决定性作用。 空间相互作用空间相互作用 A. 盐浓度增大对盐浓度增大对反胶团相产生脱水效反胶团相产生脱水效应应, 含水率含水率W0随盐浓随盐浓度的增大而降低度的增大而降低,反胶反胶团直径减小团直径减小, 空间排空间排阻作用增大阻作用增大, pro溶解溶解下降。下降。B .在各在各pro的的pI处处(排除了静电相互作用的影响排除了静电相互作用的影响)，反胶团萃，反胶团萃取实验研究表明取实验研究表明: 随着随着M增大增大, pro的分配系数的分配系数(m, 溶解率溶解率)下下降。表明随降。表明随M增大增大

37、, 空间排阻作用增大空间排阻作用增大, pro的溶解率降低的溶解率降低. 疏水性相互作用疏水性相互作用 aa的疏水性各不相同的疏水性各不相同, 研究表明研究表明, aa或肽的或肽的m随随aa疏水性的疏水性的增大而增大增大而增大 。蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式式,因而影响其分配系数因而影响其分配系数. 疏水性较大的疏水性较大的pro可能以可能以“半岛式半岛式”形式溶解。形式溶解。所以可以根据所以可以根据pro间间M的差别选择性对的差别选择性对pro进行萃取分离。进行萃取分离。2）反胶束萃取的影响因素）反胶束萃取的影响因素v水相的水相的pH值值 v

38、盐离子盐离子的种类和浓度的种类和浓度v温度温度 v蛋白质蛋白质的分子量和浓度的分子量和浓度 v表面活性剂表面活性剂 水相的水相的 pH值值 pH对萃取的影响主要体现在改变蛋白质的表对萃取的影响主要体现在改变蛋白质的表面电荷上。面电荷上。在 pH小于蛋白质的等电点(PI)时 ,蛋白质表面带正电荷 ;大于等电点时 ,蛋白质带负电荷。AOT是一种阴离子型表面活性剂 ,它所形成的反胶团的内表面带负电荷。当水溶液的 pH小于蛋白质的等电点时,两表面异电荷的吸引力使蛋白质的萃取率接近1 0 0 %。当pH大于PI时,溶菌酶萃取率急剧下降,直到接近于零 。 盐离子的种类盐离子的种类盐浓度盐浓度盐浓度W0S&

39、Pro Z萃取率温度温度v 温度是影响蛋白质萃取率的一个重要因素。温度是影响蛋白质萃取率的一个重要因素。一般来说一般来说 , ,温度的增加将使反胶团的含水量下温度的增加将使反胶团的含水量下降降 , ,因而不利于蛋白质的萃取因而不利于蛋白质的萃取。通过提高温度可。通过提高温度可以实现蛋白质的反萃取。以实现蛋白质的反萃取。 蛋白质分子量和浓度蛋白质分子量和浓度u 蛋白质的分子量对其萃取率有蛋白质的分子量对其萃取率有较大影响。较大影响。 例如溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋例如溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的分子白酶的分子 量分别为量分别为 14300、23300、35000 , AOT/ 异辛烷反异辛烷反胶团萃

40、取它们的最大萃取率分别胶团萃取它们的最大萃取率分别约为约为 1 0 0 %、90 %、3 0 % ,表表明明分子量越大的蛋白质越难萃取分子量越大的蛋白质越难萃取。u用用 AOT反胶团体系萃取血红反胶团体系萃取血红蛋白时发现蛋白时发现 , 蛋白质浓度高时蛋白质浓度高时,萃取率降低萃取率降低;而蛋白质浓度低时而蛋白质浓度低时,萃取率较高。萃取率较高。表面活性剂表面活性剂v表面活性剂的表面活性剂的类型类型目前最常用的反胶团或微乳液是目前最常用的反胶团或微乳液是 AOT/AOT/异辛烷异辛烷体系。体系。一是一是AOTAOT形成的反胶团较大形成的反胶团较大 , ,有利于蛋有利于蛋白质的萃取白质的萃取 ;

41、 ;二是二是AOTAOT形成反胶团时不需加助形成反胶团时不需加助表面活性剂表面活性剂。v表面活性剂的表面活性剂的浓度浓度当其它条件一定时当其它条件一定时 , ,表面活性剂浓度也存在某表面活性剂浓度也存在某临界值。临界值。小于此临界值时小于此临界值时 , ,增大表面活性剂的增大表面活性剂的浓度可提高蛋白质的萃取率浓度可提高蛋白质的萃取率 , ,大于临界值时大于临界值时 , ,则无明显影响则无明显影响四、四、 反胶团萃取的应用反胶团萃取的应用v 分离蛋白质混合物；分离蛋白质混合物；v 浓缩浓缩-淀粉酶；淀粉酶；v从发酵液中提取胞外酶从发酵液中提取胞外酶 ；v直接提取胞内酶；直接提取胞内酶；v用于蛋

42、白质复性。用于蛋白质复性。案例一：案例一： 通过三步分离操作分离了核糖核酸酶通过三步分离操作分离了核糖核酸酶a、细胞色素细胞色素c和溶菌酶。和溶菌酶。 依据原理依据原理1 依据原理依据原理2 v通过调节通过调节水相水相pHpH值和值和KClKCl浓度浓度来实现三种蛋白质的来实现三种蛋白质的分离。分离。在在pH=9pH=9时，核糖核酸酶的溶解度很小，保留时，核糖核酸酶的溶解度很小，保留在水相而与其他两种蛋白质分离；相分离后得到的在水相而与其他两种蛋白质分离；相分离后得到的反胶团相（含细胞色素反胶团相（含细胞色素C C和溶菌酶）与和溶菌酶）与0.5 mol/L0.5 mol/L的的KClKCl水溶

43、液接触后，细胞色素水溶液接触后，细胞色素C C被反萃取到水相，而被反萃取到水相，而溶菌酶留在反胶团相；含溶菌酶的反胶团与溶菌酶留在反胶团相；含溶菌酶的反胶团与2.0 2.0 mol/L KClmol/L KCl，pHpH值为值为11.511.5的水相接触后，将溶菌酶的水相接触后，将溶菌酶反萃至水相中。反萃至水相中。案例二：案例二： 使用二级混合使用二级混合-分离型萃取流程，用分离型萃取流程，用TOMAC/0.1%辛醇辛醇-异辛烷的溶液体系连续分异辛烷的溶液体系连续分离离 -淀粉酶，浓缩了淀粉酶，浓缩了17倍。倍。(图图)案例三案例三 ： 胞内酶的提取胞内酶的提取 大量的研究工作已经证明了反胶团

44、萃取法提取蛋白质的大量的研究工作已经证明了反胶团萃取法提取蛋白质的可行性与优越性。不管是自然细胞还是基因工程细胞中的产可行性与优越性。不管是自然细胞还是基因工程细胞中的产物都能被分离出来物都能被分离出来;不仅发酵滤液和浓缩物可通过反胶团萃取不仅发酵滤液和浓缩物可通过反胶团萃取进行处理进行处理,就是发酵清液也可同样进行加工就是发酵清液也可同样进行加工。不仅是蛋白质和。不仅是蛋白质和酶都能被提取酶都能被提取,还有核酸、氨基酸和多肽也可顺利地溶于反胶还有核酸、氨基酸和多肽也可顺利地溶于反胶团。团。 然而反胶团萃取在真正实用之前还有许多有待于研究和然而反胶团萃取在真正实用之前还有许多有待于研究和解决的

45、问题解决的问题,例如表面活性剂对产品的沾染、工业规模所需的例如表面活性剂对产品的沾染、工业规模所需的基础数据基础数据;反胶团萃取过程的模拟和放大技术等。尽管如此反胶团萃取过程的模拟和放大技术等。尽管如此,用用反胶团萃取法大规模提取蛋白质由于具有成本低、溶剂可循反胶团萃取法大规模提取蛋白质由于具有成本低、溶剂可循环使用、萃取和反萃取率都很高等优点环使用、萃取和反萃取率都很高等优点,正越来越多地为各国正越来越多地为各国科技界和工业界所研究和开发。科技界和工业界所研究和开发。第五节第五节 超临界流体萃取超临界流体萃取（supercritical fluid, SCFsupercritical flu

46、id, SCF）一一. 序序 言言超临界流体萃取超临界流体萃取：是将：是将超临界流体作为萃取溶剂超临界流体作为萃取溶剂的一种萃取的一种萃取技术，它兼有传统的技术，它兼有传统的蒸馏和液液萃取蒸馏和液液萃取的特征，是适用面很的特征，是适用面很广的一门新型分离技术。广的一门新型分离技术。超临界流体超临界流体：是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点下物质特有的点临界点后的流体临界点后的流体。通常有二氧化碳。通常有二氧化碳（COCO2 2 ）、氮气）、氮气 （N N2 2 ）、氧化二氮）、氧化二氮 （N N2 2 O O）、乙烯）、乙烯 （C C2

47、 2 H H4 4）、三氟甲烷）、三氟甲烷 （CHFCHF3 3 ）等。）等。 超临界流体（超临界流体（SCF）的特性的特性物质状态物质状态 密度（密度（g/cm3）粘度粘度(g/cm/s)扩散系数扩散系数(cm2/s )气态(0.6-2) 10-3(1-3) 10-4 0.1-0.4液态0.6-1.6(0.2-3) 10-2 (0.2-2) 10-5 SCF0.2-0.9(1-9) 10-4 (2-7) 10-4 由以上特性可以看出，由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双超临界流体兼有液体和气体的双重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性

48、好，与液体溶剂相比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现的实现。v超临界流体的超临界流体的密度接近液体密度接近液体，因此具有与液，因此具有与液体相近的溶解能力。体相近的溶解能力。v超临界流体的超临界流体的粘度和扩散系数又与气体相近粘度和扩散系数又与气体相近似似，而溶剂的低黏度和高扩散系数的性质是，而溶剂的低黏度和高扩散系数的性质是有利于传质的。有利于传质的。v由于以上特点，超临界流体可以迅速渗透到由于以上特点，超临界流体可以迅速渗透到物体的内部溶解目标物质，快速达到萃取平物体的内部溶解目标物质，快速达到萃取平衡。衡。二、二、 超

49、临界流体的萃取原理超临界流体的萃取原理 物质之间的溶解能力主要取决于物质分子之间的相似性，物质之间的溶解能力主要取决于物质分子之间的相似性，一是分子结构相似，二是分子间的作用力相似一是分子结构相似，二是分子间的作用力相似。而分子结构。而分子结构之间的相似相溶在很大程度上也可以归结到作用能相似上。之间的相似相溶在很大程度上也可以归结到作用能相似上。真空或萃取剂分子密度极低时，溶剂对溶质的作用能极小，真空或萃取剂分子密度极低时，溶剂对溶质的作用能极小，溶质的溶解度也就极小了。溶质的溶解度也就极小了。 真空真空“溶解溶解”物质的能力极低。加入超临界气体萃取溶物质的能力极低。加入超临界气体萃取溶剂（接

50、近于液体密度），溶质的溶解度与真空中的溶解度相剂（接近于液体密度），溶质的溶解度与真空中的溶解度相比，大幅度增加（一亿多倍）。比，大幅度增加（一亿多倍）。 在超临界流体萃取中，主要是溶剂流体在超临界流体萃取中，主要是溶剂流体密度密度的的大幅度增加导致溶剂对溶质的大幅度增加导致溶剂对溶质的作用力大幅度增加作用力大幅度增加，从而形成了溶解物质的能力，这个特性给溶剂流体从而形成了溶解物质的能力，这个特性给溶剂流体回收、溶剂与溶质分离带来方便。回收、溶剂与溶质分离带来方便。 在超临界萃取后的在超临界萃取后的分离操作中，可在与萃取温分离操作中，可在与萃取温度相同的条件下，降低压力使溶剂的密度下降，引度相